蛋白质分离与纯化教学设计说明
实验教学内容：血清蛋白质的分离与纯化
实验教学内容：血清蛋白质的分离与纯化实验教学时间：(本实验需12学时，分3次实验完成)教学对象：临床医学、护理学、影像各专业实验目的：1、分离血清得到高纯度的白蛋白2、掌握蛋白质盐析原理与实验操作技术、葡聚糖凝胶G-25脱盐原理与实验操作技术、DEAE-纤维素离子交换原理与实验操作技术、考马斯亮蓝G250染色法定量检测蛋白质的原理和操作方法、SDS-PAGE电泳的原理和操作技术3、掌握紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪、恒压高位槽的原理与使用方法教学重点：1、熟悉蛋白质分离纯化的思路和一般方法；2、掌握蛋白质盐析原理、葡聚糖凝胶G-25脱盐原理、DEAE-纤维素离子原理、考马斯亮蓝G250染色法定量检测蛋白质的原理和SDS-PAGE电泳的原理；3、掌握凝胶层析、离子交换层析法、考马斯亮蓝G250染色法和SDS-PAGE电泳的实验操作技术4、掌握紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪、恒压高位槽的原理与使用方法教学难点：1、DEAE-纤维素离子原理；2、SDS-PAGE电泳的原理；3、凝胶层析、离子交换层析法和SDS-PAGE电泳的实验操作技术；4、紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪的使用方法教学方法：幻灯片结合黑板板书，并有教师演示操作教学内容及时间分配：第一次实验（4小时）：1、讲解实验目的、思路和安排（10分）2、盐析的原理（5分）3、脱盐的原理和方法比较（10分）4、盐析和凝胶层析的操作步骤（10分）5、紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪、恒压高位槽的原理与使用（30分）6、学生开始调试仪器、测定流速、设置实验条件（10分）7、学生进行盐析（15分）8、教师演示上样操作（5分）9、学生脱盐处理、收集样品并保存（2小时）10、学生平衡层析柱，处理图形并记录（20分）第二次实验（4小时）：1、分析上次实验结果和总结经验（10分）2、讲解离子交换的原理（15分）3、离子交换的操作步骤（10分）4、复习紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪、恒压高位槽的使用（5分）5、学生开始调试仪器、测定流速、设置实验条件（10分）6、学生把上次样品进行处理、收集样品并保存（3小时）7、学生再次平衡离子交换柱，处理图形并记录（20分）第三次实验（4小时）：1、分析上次实验结果和总结经验（5分）2、讲解蛋白质定量方法的原理和各个方法的比较（10分）3、考马斯亮蓝G250染色法的操作步骤（5分）4、讲解SDS-PAGE电泳的原理和操作技术（20分）5、学生用考马斯亮蓝G250染色法检测并计算样品中蛋白质浓度（10分）6、学生制胶、并对上次保存样品进行处理（2小时）7、学生上样、电泳（2小时）8、教师指导学生剥胶（30分）9、教师对凝胶进行染色、漂洗（课下操作，在下次实验时观察实验结果）。
蛋白质的提取与分离纯化
一、吸附层析
5、应用
分离纯化生物大分子
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二、分配层析
分配层析是利用各组分在两相中的分配 系数不同，而使各组分分离的方法。
分配系数是指一种溶质在两种互不相溶 的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两 项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确 定后，分配系数是一常数，用K表析中，通常采用一种多孔性固体支持物 （如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为 固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔 支持物上。 • 另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定 相流动，称为流动相。 • 当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质 在两相之间进行连续的动态分配。
两种离子交换剂
阴离子交换剂： 常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基
DEAE QAE
－C2H4N+(C2H5)2H －C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3
阳离子交换剂： 常用羧甲基 CM 磺丙基 SP
—CH2COO－ —C3H6SO3－
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离子交换葡聚糖
类型
DEAE-Sephadex A-25 ，A-50 QAE-Sephadex A-25 ，A-50 CM-Sephadex C-25 ，C-50 SP-Sephadex C-25 ，C-50
分配系数Ka的意义：
1) 可定量地衡量各组分的流出顺序。
2) 判断分离效果，Ka差异大，分离效果好， Ka差异小，分离效果差。
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蛋白质的洗脱体积与其分子量有关
LogM=k1-k2Ve LogM A B LogM 测 V测 C （Ve为洗脱体积）
先测得几种标 准蛋白质的Ve，并 以其分子量对数对 Ve作图得一直线， 再测出待测样品的 Ve，查标准曲线即 可确定分子量。
第七章 蛋白质的分离纯化
Ff(摩擦力) = fν = f(dχ/dt) 通过测定沉降界面的移动速度测定Mr. dx/dt为 常数 F c- F b = F f
(dχ/dt) mp（1-υ ρ ） = 2χ ω f
沉降系数：单位离心力场的沉降速度叫沉降系数， 用s表示。
s=(dx/dt)/ω 2χ= mp(1-υ ρ )/f
也叫凝胶过滤层析
在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内 部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外， 而小分子可以进人凝胶颗粒内部的多孔 网状结构，流速缓慢，以致最后流出柱 外，从而使样品中分子大小不同的物质 得到分离。
A.小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞 留，大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之 间迅速通过。 B.(1)蛋白质混合物上柱； (2)洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大 分子则被排阻在颗粒之外，大小分子开始分开； (3)小分子被滞留，大分子向下移动，大小分 子完全分开； (4)大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分 子尚在行进中。
元素原子量(分子分子量 )
最低相对分子量=
元素(分子)百分含量
肌红蛋白含铁量为0.335%，其最低分子量可 按下式算出： Fe原子量(55.8 ) 最低相对分子量= Fe元素百分含量 (0.335%) =16700
真实分子量是最低相对分子质量的n倍，这 里n是每个蛋白质分子中铁原子的数目。因 为肌红蛋白中，n＝l，所以其真实Mr 就是 16700。又如血红蛋白含铁也是0.335%， 即最低Mr亦为16700，但根据其他方法测得 的Mr是68000。可见每一分子血红蛋白含有 四 个 铁 原 子， 即 n ＝ 4， 因 此 其 真 实Mr ＝ 16700×4 = 66800。
蛋白质的提取、分离纯化及定量
实验一氨基酸的别离鉴定——纸层析法实验目的1.学习氨基酸纸层析的根本原理。
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。
实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。
将样品点在滤纸上〔原点〕，进展展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进展分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA别离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用比移〔rate of flow ,Rf〕来表示Rf= 原点到层析点中心的距离〔*〕/原点到溶剂前沿的距离(Y)只要条件〔如温度、展层剂的组成〕不变，*种物质的Rf值是常数。
可根据R f 作为定性依据。
Rf值的大小与物质的构造、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
样品中如有多种AA，其中有些AA的Rf值一样或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而到达别离的目的，这种方法叫双向层析。
仪器、试剂1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进展混合得混合液。
将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。
取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
2、氨基酸溶液⑴.单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、⑵.混合氨基酸：各5 ml混合。
3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
4、层析缸、滤纸〔14*17〕、喷雾器、电吹风实验步骤1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。
2.准备滤纸：取层析滤纸〔长17㎝、宽14㎝〕一*。
在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。
蛋白质的分离和纯化精品课件
• A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果
• B、气泡阻碍蛋白质的运动 • C、气泡与蛋白质发生化学反应 • D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密
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2、样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A
• A 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱 内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
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4、在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷
酸缓冲液处理的目的是 A.防止血红蛋白被O2氧化
( D)
B.血红蛋白是一种碱性物质，需要酸中和
C.磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程
D.让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其 结构和功能
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5、下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的
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50cm高
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样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到 与凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶 端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样， 同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝 胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
• B.采用透析法使蛋白质与其他小分子化合 物分离开来
• C.离心沉降法通过控制离心速率使分子大 小、密度不同的蛋白质分离
• D.蛋白质在电场中可以向与其自身所带电 荷相同的电极方向移动
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三、血红蛋白的提取和分离
1.样品处理 2.粗分离 3.纯化 4.纯度鉴定
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1.样品处理
叙述中，正确的是 ( D )
A.用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去 除细胞表面杂蛋白
11第十一讲蛋白质的分离与纯化(二)课件
类脂和色素等等。（分离并洗脱）
薄层层析：（只分离不洗脱），例如：硅胶薄层层析和聚酰胺薄膜薄层层析
硅胶薄层层析：
•
硅胶板分类（4类），硅胶H（纯硅胶），能用腐蚀性强的显色剂；硅胶
G（10%-15%煅石膏和 5%淀粉的硅胶）；硅胶CMC （含羧甲基纤维素）； 硅胶HF254(含荧光剂的硅胶H)。 硅胶板的制备：玻璃板，硅胶制备（加溶剂碾磨），铺板，活化和 合格检查：约1mg苏丹黄、苏丹红和靛酚蓝混合物乙酸乙酯溶液点样，苯：
二、常见色谱介绍
1、吸附分离色谱？
（1）概念：
利用固相吸附剂对不同物质的吸附力不同，进行物质分离的液相色谱技术。
（2）原理：
通过范德华力，流动相中的分子与固定相（吸附剂）吸附、再解吸附进 入流动相（洗脱剂）。
不同物质在固相和液相之间分配系数或解离平衡不同。 通过连续的吸附—解吸附—再吸附过程将物质分离。
– –
亲水性离子交换剂（亲水性较大的合成物质，纤维素、葡聚糖、交联琼脂糖等）
阳离子交换剂 阴离子交换剂
常用固定相介质
– DEAE（二乙基胺基乙基）— Cellulose DE-32 – DEAE—Cellulose DE-52 – DEAE- Sephadex A-50（25） – DEAE-Sepharos CL-6b
2、液相色谱的发展
• 在色谱技术中，液相色谱（Liquid chromatography）是最早（1903年）发 明的，但其初期发展比较慢。 • • 液相色谱普及之前，纸色谱、气相色谱和薄层色谱是色谱分析的主流。 20th60S’，将较为成熟的气相色谱 理论与技术应用于液相色谱，使液相色谱 迅速发展。 • 特别是填料（色谱柱）制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使 液相色谱分析实现了高效化和高速化。 • 1969年，液相色谱仪商品化。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色 谱被称为高效液相色谱法（HPLC） • • 更加 微量、快速、高效、广泛。 新进展：微柱—HPLC、无孔色谱短柱—HPLC、毛细管—HPLC
蛋白质分离纯化技术实验讲义
蛋白质分离纯化技术实验讲义实验一蛋白质含量分析（bradford检测法）一、实验目的1、制作蛋白质浓度标准曲线；2.测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线计算蛋白质浓度。
二、实验原理布拉德福德法（考马斯亮蓝法）由布拉德福德于1976年建立。
这是最常用的蛋白质快速定量方法。
该方法是根据蛋白质与染料结合的原理设计的。
考马斯亮蓝G-250（CBBG-250）在自由态为红色，最大光吸收为488nm；当它在酸性溶液中与蛋白质结合时，就会变成青色。
蛋白质-染料偶联物在595nm波长处具有最大的光吸收，且光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝的结合在约2min内达到平衡，反应很快完成，其结合物在室温下1h内保持稳定。
bradford法的突出优点是：灵敏度高；测定快速、简便，只需加一种试剂；干扰物质少。
此法的缺点是：仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物有去污剂、tritonx-100、sds和0.1n的naoh。
三、试剂和设备1。
试剂：1mg/ml牛血清蛋白（bsa）母液；考马斯亮蓝g-250；无水乙醇；85%磷酸；miliq水。
2、器材：滤纸；烧杯；漏斗可见分光光度计；试管四、实验方法1.考马斯亮蓝G-250染料的结构称100mg考马斯亮蓝g-250，溶于47.5ml无水乙醇后，再加入100ml85%的磷酸，加miliq水定容至1l，过滤备用。
2、标准蛋白溶液的稀释取10根试管，按表中顺序排列，分别加入考马斯亮蓝溶液、水和样品。
每加完一管，立即振荡混匀（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。
未知样品的编号为8、9、10号管。
3.加入试剂2-5分钟后，用反应杯在分光光度计上测量每个样品在595nm处的吸光度值od595。
注意：不要使用石英反应杯（因为它不容易清洗和染色）。
可以使用塑料或玻璃反应杯。
使用后立即用少量95%乙醇冲洗。
塑料反应杯不能在乙醇或丙酮中长时间浸泡。
《蛋白质分离、纯化》PPT课件
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带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
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凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
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蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
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• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
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一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
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凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
蛋白质的分离纯化实验报告
蛋白质的分离纯化实验报告一、实验目的1、掌握蛋白质分离纯化的基本原理和方法。
2、学会运用不同的技术手段对蛋白质进行提取、分离和纯化。
3、熟悉蛋白质纯度鉴定的常用方法。
二、实验原理蛋白质是生物体中重要的大分子化合物，其分离纯化是研究蛋白质结构和功能的重要前提。
蛋白质的分离纯化主要依据其物理化学性质的差异，如分子大小、电荷、溶解度、亲和力等。
常见的分离纯化方法包括：1、盐析法：通过向蛋白质溶液中加入中性盐，如硫酸铵，使蛋白质溶解度降低而沉淀析出。
2、凝胶过滤层析：利用凝胶颗粒的多孔网状结构，根据蛋白质分子大小进行分离。
3、离子交换层析：基于蛋白质所带电荷的不同，在离子交换树脂上进行吸附和解吸。
4、亲和层析：利用蛋白质与特定配体之间的特异性亲和力进行分离。
三、实验材料与设备1、材料新鲜的动物组织（如肝脏）各种试剂，包括硫酸铵、磷酸盐缓冲液、离子交换树脂、亲和配体等。
2、设备离心机层析柱紫外分光光度计电泳仪四、实验步骤1、蛋白质的提取将新鲜的动物组织剪碎，加入适量的磷酸盐缓冲液，在冰浴中匀浆。
低温离心（4℃，10000 rpm，20 min），收集上清液，即为粗提的蛋白质溶液。
2、盐析沉淀在上清液中缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，使其饱和度逐渐增加到 50%。
搅拌 30 min 后，低温离心（4℃，10000 rpm，20 min），收集沉淀。
3、凝胶过滤层析装柱：将凝胶颗粒填充到层析柱中，用缓冲液平衡柱子。
上样：将盐析沉淀溶解后，缓慢上样到层析柱中。
洗脱：用缓冲液进行洗脱，收集不同洗脱峰的流出液。
4、离子交换层析装柱：将离子交换树脂填充到层析柱中，用起始缓冲液平衡柱子。
上样：将凝胶过滤层析收集的样品上样到离子交换层析柱中。
洗脱：采用梯度洗脱的方法，逐渐改变缓冲液的离子强度，收集洗脱峰。
5、亲和层析装柱：将亲和配体偶联到层析介质上，填充到层析柱中，用平衡缓冲液平衡柱子。
上样：将离子交换层析收集的样品上样到亲和层析柱中。
蛋白质的分离与纯化技术(2007-2008).ppt
G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
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等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力 最小，因而溶解度也最小。
各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节 溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉 淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结 合用。
因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低，蛋白质分子 表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了 蛋白质分子的聚集和沉淀。
有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相似， 与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚集而沉淀。
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(3) 细分级分离 (fine fractionation)
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如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞 核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用 差速离心方法将它们分开
如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞
器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构
解聚，然后用适当的介质提取。
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细胞破碎方法总结
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蛋白质的分离与纯化技术(20072纯化的目的 二． 蛋白质分离纯化的依据（蛋白质的特
性） 三． 蛋白质稳定存在的影响因素 四． 蛋白质分离纯化的一般程序 五． 蛋白质的分离纯化方法 六． 浓缩、干燥及保存
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一、蛋白质分离纯化的目的
研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理
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蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分 子中保留着游离的末端α—氨基和α—羧 基以及侧链上的各种功能团。蛋白质也 是一类两性电解质，能和酸或碱发生作 用。可解离基团主要来自侧链上的功能 团。
第一章蛋白质的分离与纯化课件
第十一页，共73页
反复冻融法：由于在此过程中易使活性蛋白失活 ，故适用于提取非常稳定的蛋白质
冷热交替法：绝大多数细胞被破坏，一般适用 于从细菌或病毒中提取蛋白质
低渗裂解：是指无胞壁细胞在低渗溶液中通过渗 透张力作用裂解的方法，常用于红细胞的裂解
第十二页，共73页
❖ 化学法
有机溶剂法：有些有机溶剂(如苯、甲苯等)
可以改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择性 的渗透出来
表面活性剂(去垢剂)：常用的有十二烷基磺酸 钠、TritonX-100、去氧胆酸钠等
酶解法：必须根据细胞的结构和化学组成选 择适当的酶
第十三页，共73页
❖ 特异、快速、精确、可重复、经济 ❖ 总蛋白含量 ❖ 蛋白质比活性（specific activity） ❖ 得率
❖ 还原剂
❖ 去垢剂 (detergent) ❖ 蛋白酶抑制剂 ❖ 蛋白质的环境因素
第二十四页，共73页
第二节 层析的基本理论
1906年 M.Tswett Adsorption Chromatography 1941年 Martin and Synge Partition Chromatography
因此，通常实际的洗脱曲线都比理论曲线低而宽
第三十五页，共73页
一根分配层析柱上到底能进行多少次分配？
➢ Martin和Synge计算了硅胶柱的理论塔板数， 求得一个理论塔板的高度为0.002厘米
➢ Verzele计算为0.02厘米
➢ 1厘米的层析柱最少有50个理论塔板，那么，
在一根20厘米的层析柱上最少可以进行1000 次分配。
匀浆：破碎机体软组织最常用方法之一 组织捣碎：注意维持低温环境
实验二鸡蛋中蛋白质的分离纯化
鸡蛋中卵球蛋白与卵清白蛋白的分离一、实验目的了解盐析分级分离蛋白质的基本原理及操作.了解葡聚糖凝胶SephadexG-75分离蛋白质的基本原理和凝胶柱的制备及洗脱技术.二、实验原理盐析的原理:蛋白质是亲水胶体,在高浓度的中性盐影响下脱去水化层,同时,蛋白质分子所带的电荷被中和,结果蛋白质胶体的稳定性遭到破坏而沉淀析出。
盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质的种类及pH有关.分子量大的蛋白质(球蛋白)比分子量小(白蛋白)易析出。
改变盐浓度,使不同分子量的蛋白质分别析出。
分子筛层析。
三、实验用品仪器：752型紫外可见分光光度计、离心机、层析装置器皿：5ml试管20支、50ml烧杯2个、试管架、玻棒、石英比色皿、玻璃层析柱药品及材料：新鲜蛋清、固体硫酸铵、饱和硫酸铵溶液、凝胶SephadexG-75四、实验步骤1、卵球蛋白与卵清蛋白的初步盐析分离取卵清２ml于试管中；加２ml的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀；静置２分钟；4000r/min离心５分钟；沉淀为卵球蛋白,量取取上清液，加入固体硫酸铵（计算3ml溶液饱和度由５０％变化为１００％需要加入硫酸铵的克数1.5g）；8000r/min,离心５分钟；沉淀为卵清白蛋白。
加入2ml蒸馏水溶解卵清白蛋白粗液。
2、凝胶柱层析进一步分离（1）湿装法装柱：老师演示(2) 加样：用加样枪加入1毫升卵清蛋白粗液（3）洗脱:用蒸馏水洗脱(3) 收集与检测:(4) 以洗脱体积为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制洗脱曲线,将蛋白质溶液收集待用.五、实验结果及分析绘制洗脱曲线0612182430364248546000.0110.7670.4680.2430.040.0570.0240.0690.0170.053卵清白蛋白的分离和脱盐-0.200.20.40.60.81020406080体积A -595系列1do。
蛋白质的分离纯化讲解
①从生物材料中分离制备蛋白质，研究其结构与 功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现 象的本质有重大意义。
②工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等 工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉 酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。
③医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。 ④基因工程的需要
特点
在 pH<8.6 应用
阴离子 DEAE—
常用的离子交换纤维素
的生物亲和力
1、粗分级分离
▪ 主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶 剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量 的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、 处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩 蛋白质，但分辨率低。
（1）盐析
向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4)2SO4， Na2SO4]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称 为盐析。
(NH4)2SO4
血清
50%饱和度
球蛋白
析出
清蛋白
100%饱和 析出
（2）等电点沉淀
蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数 量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液pH值 等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。
不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节 溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而 与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。
第四节 蛋白质的层析分离
应用广泛。特征：有一个固定相和一个流动相。 由于待分离的各种物质在这两个相分配系数不 同，当两个相作相对运动时，这些物质在两相 间反复多次分配，结果使其相互分开。
根据两相的状态，层析法可分为：气相层析和 液相层析；按层析原理可分为：吸附层析、分 配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和 层析等。按操作形式分为：柱层析、薄层层析、 纸层析等。
蛋白质分离纯化技术实验讲义
实验一蛋白质含量分析（Bradford检测法）一、实验目的1、制作蛋白质浓度标准曲线；2、测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白质的浓度。
二、实验原理Bradford法（考马斯亮蓝法）测定蛋白质浓度是1976年由Bradford建立的，是最常用的蛋白质快速定量方法。
该方法根据蛋白质与染料相结合的原理设计，考马斯亮蓝G-250（CBB G-250）在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它在酸性溶液中与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-染料结合物在595nm波长下有最大光吸收，且光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。
Bradford法的突出优点是：灵敏度高；测定快速、简便，只需加一种试剂；干扰物质少。
此法的缺点是：仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物有去污剂、Triton X-100、SDS和0.1N的NaOH。
三、试剂与器材1、试剂：1mg/ml 牛血清蛋白（BSA）母液；考马斯亮蓝G-250；无水乙醇；85%磷酸；MiliQ水。
2、器材：滤纸；烧杯；漏斗；可见分光光度计；试管。
四、实验方法1、考马斯亮蓝G-250染料的配置称100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于47.5 ml 无水乙醇后，再加入100 ml 85%的磷酸，加MiliQ水定容至1 L，过滤备用。
2、标准蛋白溶液的稀释取10支试管，按表中顺序排列，分别加入考马斯亮蓝溶液、水和样品。
每加完一管，立即振荡混匀（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。
未知样品的编号为8、9、10号管。
3、加完试剂2-5min后，即可用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的吸光值OD595。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇冲洗，塑料比色皿不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
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蛋白质分离与纯化教学设计 一、教学背景分析 【教材分析】 “蛋白质的分离与纯化”实验是《高中生物》选修1生物技术实践 5.3血红蛋白的提取与分离中的容。本节课的主要容包括蛋白质的提取、分离纯化等基本知识，主要要求学生掌握凝胶电泳的实验原理以及操作方法。“血红蛋白分离与纯化”实验不仅是学习血红蛋白的提取、分离纯化方法，而且也是进一步掌握蛋白质的组成、结构和功能的基础。
【学情分析】 到目前为止，学生已经学习了蛋白质的相关知识，对蛋白质有了一定的了解，“蛋白质的分离与纯化”实验目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取和纯化生物大分子的基本原理、过程和方法，虽然操作难度较大，但原理清晰，动手机会较多，学习兴趣很高。学生有必修“生命活动的主要承担者——蛋白质”的基础，在一定程度上掌握了蛋白质的组成、结构和功能等基础知识，学生在进行实验前还是能大概了解影响蛋白质分离纯化的因素的，再者经过老师的指导，实验能取得良好的结果的。
二、教学目标 【知识目标】 1.了解从血液中提取蛋白质的原理与方法。 2.说出凝胶电泳的基本原理与方法。 【能力目标】 运用凝胶电泳对蛋白质进行分离纯化。 【情感态度与价值观目标】 1.培养学生科学实验的观点。 2.初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神。
三、教学重难点 【教学重点】 从血液中提取蛋白质；凝胶电泳分离纯化蛋白质。 【教学难点】 样品预处理，色谱柱的装柱，纯化分离操作。 四、实验实施准备 【教师准备】 1.分组。学生按学科能力的强中弱平均分组，各组尽量平衡，各组自行分工，并由实验员统一安排实验过程。 2.实验材料：血液 仪器：试管、胶头滴管、烧杯、玻璃棒、离心机、研磨器 、透析袋、电泳仪等。 试剂：20mmol/L磷酸缓冲液（pH为8．6）、蒸馏水、聚丙烯酸铵、生理盐水、5％醋酸水溶液等。
【学生准备】 1.预习实验“蛋白质分离纯化”，了解蛋白质的相关信息。 2.进行分组。 五、教学方法 【教法】 分析评价法、任务驱动法、直观演示法 【学法】 自主学习法、合作交流法
六、教学媒体 黑板、多媒体 七、课时安排 两个课时（80min） 一个课时用来讲述理论部分知识：样品处理与色谱柱分离纯化蛋白质的原理与方法； 另一课时用来进行实验。 八、教学过程
教学环节 教师行为 学生活动 教学意图
课前1.布置学习目标与预习提纲，要求学生完成预习1.学生进行让学生了解准备 任务。 2.准备实验用具、材料、试剂等。 预习并思考 实验容，熟悉实验流程。 教学过程 一、导入 由蛋白质是生命活动的基本承担者引出本实验对蛋白质分离纯化的重要性。 引起学生的注意与兴趣。为后面实验的顺利进行铺垫。 样品处理与提取 1.讲述怎样处理血液和从血液中提取血红蛋白； 2．动物血液的收集与处理 3.提取 组织细胞的破碎 释放蛋白质 抽提蛋白质 离心出去固体杂质 蛋白质粗制品 认真听老师讲述注意事项； 自己动手进行样品处理与分离。
培养学生的动手能力
蛋白质分离纯化 一．分离纯化 1.原理：蛋白质之间以及蛋白质与其他物质之间在分子大小、溶解度、所带电荷的多少、吸附性质等方面存在差异。 2.方法 透析法：利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性使蛋白质与其他小分子化合物分离开来。 电泳法 a．含义：带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象； b．原理：不同物质在同一电场中的泳动速度不同； c．泳动特点：带电颗粒直径越小，越接近于球形，所带净电荷越多，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。 倾听，了解电泳的实验原理和操作方法
使学生初步知道凝胶电泳的操作方法，让学生在接下来的实验中能更好的进行。 操作流程 凝胶试剂的准备 制胶 上样 实施电泳 观察电泳结果 二、老师实验演示 给学生演示操作方法，在演示的过程中同时要做的工作： 1.介绍实验所用到的仪器和试剂，明确用法和用量； 2.提醒学生应注意的事项
观看老师的演示，纪录老师强调的注意事项。 各组根据老师提供的实验方法展开实验。
通过演示，使学生掌握具体的操作过程，以及要注意的事项。 使学生主动参与学习，体验过程；相互学习，取长补短。 总结 通过本次实验教师所发现的问题。 1.让学生以小组为单位交流并讨论实验过程中出现的问题与决定实验成败的因素。 2.教师总结：实验结果分析 布置课堂作业 学生讨论交流并思考影响实验结果的因素； 完成教师布置的作业。 让学生进一步掌握蛋白质的基本结构与功能；分离纯化的方法 及时复习。
九、教学设计反思 本实验重在让学生了解生物科学在蛋白质领域的进展，说明分离、纯化高纯度的蛋白质的重要性和必要性，并学习一些蛋白质分离和纯化的基本技术。可以发挥学生的主动性，让学生介绍当前有关蛋白质研究的新进展，激发学生的学习兴趣，让学生初步体会分离纯化蛋白质的过程和方法。 本节课的教学主要是教师讲授知识并演示实验操作过程，让学生更形象的了解蛋白质分离纯化实验的要点。 当然通过这节课的教学，我也收获了不少，让我对今后的实验课的教学有了更深刻的认识，更明确了上好一节科学课的基本模式，同时我也在思考一个问题：怎样在实验室上好科学课？我想这将是我们所有科学老师今后都要思考的问题，值得探究。只有把这些问题解决了，才能在以后的教学中更上一层楼。
十、本实验近十年参考文献 [1]《蛋白质纯化与鉴定实验指南》[J]． 生物技术通讯，2004，(2)． [2]轶华，更亮，小乐，菊敏，蔡丽萍，义． 阴离子交换整体柱对蛋白质的分离与纯化[J]．色谱，2005，（3）． [3]卜春苗，朱金霞,龚波林．强阳离子交换树脂在蛋白质分离纯化中的应用[J]．工程技术，2006，(1)． [4]兴华，浩如． 天然糖蛋白的提取、分离与纯化[J].．药学进展，2006，(12)． [5]朱正威，万儒，占良．选修一生物技术实践．：人民教育，2007,7:64-70． [6]王镜岩，朱圣庚，徐长法．生物化学．：高等教育，2005,4:298-312． 十一、近十年相关考题
（2008）34(8分) 科学家发现家蝇体存在一种抗菌活性蛋白。这种蛋白质具有极强的抗菌能力，受到研究者重视。 (1)分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是根据蛋白质分子的__________、大小及形状不同，在电场中的___________不同而实现分离。 答案：所带电荷的性质，迁移速度 【解析】（1）电泳法是常用的蛋白质的分离技术。电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。因为多肽具有可解离的基团，在一定的pH下基团会带上电荷。因此，在电场的作用下会向与所带电荷相反的电极移动。因为待分离样品种各种分子的所带电荷的性质以及本身分子大小不同，使得带电分子产生不同的迁移速度，从而达到分离的目的。 （2009） 23．下列关于DNA和蛋白质提取与分离实验的叙述，正确的有（ ） A．提取细胞中的DNA和蛋白质都需用蒸馏水胀破细胞 B．用不同浓度NaCl溶液反复溶解与析出DNA可去除蛋白质 C．蛋白质提取和分离过程中进行透析可去除溶液中的DNA D．蛋白质和DNA都可以用电泳的方法进行分离纯化 答案BD 【解析】A选项，在提取DNA时，如果是用动物的细胞需要用蒸馏水涨破，如果用植物细胞则不需要，而是用洗涤剂溶解细胞膜；B中，用2 mol／L的NaCl溶液溶解DNA，然后过滤出蛋白质，再降低NaCl溶液的浓度，析出DNA。DNA和蛋白质样品都是带负电荷的，从负极向正极移动，移动的距离都和样品的分子量有关。C中透析用以出去小分子物质，DNA是大分子物质。D是常规方法，比如用十二烷基磺酸钠，可以根据其分子大小及所带电荷性质进行分离纯化。
（2009） 30．回答下列与细胞有关的实验问题。 (1)下列4项实验中，需保持细胞生理活性的有_____(填序号)。 ①观察叶绿体和原生质的流动 ②观察洋葱鳞片叶表皮细胞中DNA的分布 ③探究酵母菌的呼吸方式 ④红细胞中血红蛋白的提取和分离 【答案】⑴①③ 【解析】本题考查几个大纲实验的相关知识。⑴①观察叶绿体和原生质的流动，③探究酵母菌的呼吸方式，都需保持生理活性；④提取红细胞中的血红蛋白需要破坏细胞结构，②观察细胞的DNA分布需要杀死后染色，均会导致细胞活性丧失。 （2011）5．以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是( ) A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂 B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少 C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测 D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比相对分子量较小的杂蛋白移动慢 答案D 【解析】生理盐水和红细胞的溶液为等渗溶液；各种细胞器和细胞核中都含有蛋白质，所以不含有细胞器和细胞核的红细胞，蛋白质种类较少，提纯时杂蛋白较少；血红蛋白有颜色，所以在凝胶色谱法分离过程中易分辨，可用于监测；凝胶色谱法分离蛋白质，相对分子质量较小的易进入凝胶部，移动速度比较慢，故血红蛋白比相对分子质量较小的杂蛋白移动快。 201134．研究发现柚皮精油和乳酸菌素(小分子蛋白质)均有抑菌作用，两者的