天冬酰胺酶-吴茱萸碱核壳型脂质纳米粒的药动学研究

中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０１９Ｓｅｐ；３５（９）
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ｍｍｏｌ·Ｌ－１，ｐＨ７３），自配；甲醇（色谱纯），购自美 国天地有限公司；其余试剂均为分析纯。 １．３ 仪器 Ａｇｉｌｅｎｔ１１００液相色谱仪（美国安捷伦 公司）；ＵＶ２６００紫外分光光度计（岛津仪器有限公 司）；ＭｉｌｌｉＱ超纯水系统（美国 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司）；ＴＧＬ １６Ｂ台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。 ２ 方法 ２．１ ＡＳＮａｓｅ活性的测定 ２．１．１ Ｎｅｓｓｌｅｒ试剂比色法 ＡＳＮａｓｅ可以催化天冬 酰胺分解产生游离氨，因此可以参照 Ｎｅｓｓｌｅｒ试剂比 色法［１２］，间接测定 ＡＳＮａｓｅ的活性。配制适当浓度 的天冬酰胺溶液，加入 ３７℃预热的 ＡＳＮａｓｅ血浆样 品，恒温反应 １０ｍｉｎ后，三氯乙酸终止反应。离心， 取上清液，加入 Ｎｅｓｓｌｅｒ试 剂 显 色，测 定 紫 外 吸 收。 根据氨氮标准曲线计算反应生成的氨量。１个酶活 力单位是指在实验温度 ３７℃、ｐＨ７３条件下，转化 １μｍｏｌ天冬酰胺所需的 ＡＳＮａｓｅ量。 ２．１．２ 线性范围 配制系列硫酸铵标准溶液，含氮 浓度分别为 ０、４０、８０、２００、４００、４８０、６００、８００ｍｇ· Ｌ－１，分别按“２１１”项处理后（ＡＳＮａｓｅ血浆样品替 换为空白血浆），最终测定的氮浓度分别为 ０、０１、 ０２、０５、１０、１２、１５、２０ｍｇ· Ｌ－１。 以 不 含 氮 组 样品为空白参比，测定其余各样品在 ４２０ｎｍ处的吸 光度，根据氮浓度和吸光度值，绘制标准曲线。 ２．１．３ 重复性 配制低、中、高（８０、４００、８００ｍｇ· Ｌ－１）浓度的硫酸铵标准溶液，每个浓度 ５份，分别 按“２１１”项 处 理 后 测 定 吸 光 度 值，根 据 氮 标 准 曲 线计算各测量值之间的 ＲＳＤ，考察方法的重复性。 ２．１．４ 回 收 率 配 制 “２１３”项 溶 液，同 法 处 理 后，计算氮测得量与加入量的比值，考察方法的准确 度。 ２．２ ＥＶＯ含量的测定 ２．２．１ 血浆样品的处理 吸取 １００μＬ血浆样品， 加入 １０μＬ内标工作液（和厚朴酚 ２０ｍｇ·Ｌ－１），加 入氨水（２∶１，Ｖ∶Ｖ），涡旋 ０５ｍｉｎ后，加入 ５倍体 积的乙醚沉淀蛋白，继续涡旋 ３ｍｉｎ。所得样品溶液 于６０００ｒ·ｍｉｎ－１离心 ５ｍｉｎ，取上清液至离心管中， 氮气挥去乙醚。加入等血浆体积的甲醇复溶，涡旋， 离心，取上清液 ４０μＬ进样，检测 ＥＶＯ含量。 ２．２．２ 色 谱 条 件 色 �
收稿日期：２０１９－０４－２５，修回日期：２０１９－０６－１０ 基金 项 目：重 庆 市 基 础 与 前 沿 研 究 计 划 重 点 项 目 （Ｎｏ
ｃｓｔｃ２０１５ｊｃｙｊＢＸ００２７）；重庆市研 究 生 科 研 创 新 项 目 （Ｎｏ ＣＹＳ１７１７２） 作者简介：黄永佳（１９９４－），女，硕士生，研究方向：药物新型给药系 统与新技术，Ｅｍａｉｌ：１０７４７１７９５０＠ｑｑ．ｃｏｍ； 张景?（１９７３－），女，博士，教授，博士生导师，研究方向： 药物新型给药系统与新技术，通迅作者，Ｅｍａｉｌ：ｚｊｑｒａｅ０１＠ １６３．ｃｏｍ
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中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０１９Ｓｅｐ；３５（９）：１２８４～９
网络出版时间：２０１９－８－２２１３：３０ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０１９０８２１．１５０１．０３４．ｈｔｍｌ
天冬酰胺酶 －吴茱萸碱核壳型脂质纳米粒的药动学研究
黄永佳１，杨 林２，李 瑶３，杨 强１，杨仕钰１，张景?１
（１．重庆医科大学药学院重庆高校药物工程研究中心，重庆 ４０００１６；２．重庆医药高等专科学校药学系，重庆 ４０１３３１； ３．重庆市公共卫生医疗救治中心药学部，重庆 ４０００３６）
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０１９．０９．０１９ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１－１９７８（２０１９）０９－１２８４－０６ 中国 图 书 分 类 号：Ｒ３３２；Ｒ２８４．１；Ｒ３１２；Ｒ３４５．６９；Ｒ９６９．１； Ｒ９７７．３ 摘要：目的 考察天冬酰胺酶 －吴茱萸碱核壳型脂质纳米粒 （ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅｅｖｏｄｉａｍｉｎｅ ｃｏｒｅｓｈｅｌｌ ｌｉｐｉｄｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ， ＡＥＬＮｓ）在大鼠体内的药动学行为，比较 ＡＥＬＮｓ与游离天冬 酰胺酶（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ，ＡＳＮａｓｅ）／吴 茱 萸 碱 （ｅｖｏｄｉａｍｉｎｅ，ＥＶＯ） 的生物利用度。方法 取 １８只 ＳＤ大鼠，分别尾静脉注射 ＡＥＬＮｓ、游离 ＡＳＮａｓｅ和游离 ＥＶＯ，给药后于不同时间点大鼠 眼眶取血，分别采用 Ｎｅｓｓｌｅｒ试剂比色法和 ＨＰＬＣ法测定血 浆样品中 ＡＳＮａｓｅ和 ＥＶＯ的浓度，采用 ＤＡＳ（２１１版）软件 计算药动学参数。结果 将游离 ＡＳＮａｓｅ制备成 ＡＥＬＮｓ后， 其药时曲线下面积和平均滞留时间分别提高了 １．８３倍和 １．９４倍。ＡＥＬＮｓ中 ＥＶＯ的药时曲线下面积约为游离 ＥＶＯ 的 ２８９４倍。结论 ＡＥＬＮｓ提高了 ＡＳＮａｓｅ和 ＥＶＯ在大鼠 体内的生物利用度。
与其他小分子化疗药或放射疗法联合，用于治疗急 性淋巴细胞白血病。研究表明，接受 ＡＳＮａｓｅ治疗的 白血病患者其生存期明显延长［３］。此外，ＡＳＮａｓｅ在 实体肿瘤，如 乳 腺 癌［４］、卵 巢 癌［５］和 肺 癌［６］的 研 究 中也取得了一定的效果。但是，治疗过程中发生的 许多严重不良反应，如过敏反应、凝血异常、胰腺炎 等，限制了 ＡＳＮａｓｅ的进一步应用［７］。此外，ＡＳＮａｓｅ 还具有稳定性差、生物利用度低等不足［８］。 吴茱萸碱 （ｅｖｏｄｉａｍｉｎｅ，ＥＶＯ）是一种天然抗肿 瘤活性物质，可通过阻滞肿瘤细胞周期和诱导线粒 体凋亡而抑制肿瘤细胞［９］。但 ＥＶＯ几乎不溶于水， 生物利用度非常低，限制了其应用［１０］。前期研究发 现，将 ＥＶＯ与环糊精制备成包合物可提高 ＥＶＯ的 水溶性，增加其生物利用度 。 ［１１］ 综上所述，联合 ＡＳＮａｓｅ的肿瘤“饥饿疗法”和 ＥＶＯ的小分子化疗机制，即一方面剥夺肿瘤细胞的 营养供给，另一方面予以营养缺陷的肿瘤细胞致命 打击，理论上可以发挥良好的协同抗癌作用。为了 解决两者临床应用上的不足，本研究首次制备了新 型天冬酰胺酶 －吴茱萸碱核壳型脂质纳米粒 （ａｓ ｐａｒａｇｉｎａｓｅｅｖｏｄｉａｍｉｎｅｃｏｒｅｓｈｅｌｌｌｉｐｉｄｉｃｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ， ＡＥＬＮｓ）。首先通过透明质酸衍生物与羟丙基β环 糊精在缓冲液中的自组装作用，将 ＡＳＮａｓｅ包封进去 形成纳米粒的“核”。然后与复方药物 ＥＶＯ的环糊 精 包 合 物 （ｅｖｏｄｉａｍｉｎｅｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌβｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｃｏｍｐｌｅｘ，ＥＨ）一起包封于脂质囊壳中，从而 形成具有“核 －壳”型结构的纳米粒。ＡＥＬＮｓ具有 长循环、生物相容性好、稳定性佳等优势，理论上能 提高 ＡＳＮａｓｅ和 ＥＶＯ的生物利用度。 １ 材料 １．１ 实验动物 清洁级 ＳＤ大鼠，♂，体质量（２５０ ±２０）ｇ，购 自 重 庆 医 科 大 学 实 验 动 物 中 心，合 格 证 编号：ＳＣＸＫ（渝）２０１６０００１。 １．２ 药物与试剂 ＡＳＮａｓｅ，纯度 ９６％，来源于 Ｅ． ｃｏｌｉ．，购自以色列 Ｐｒｏｓｐｅｃ公司；ＥＶＯ，纯度 ＞９９％， 购自武汉远 城 科 技 发 展 有 限 公 司；天 冬 酰 胺，纯 度 ９８％，购 自 美 国 Ｓｉｇｍａ公 司；ＴｒｉｓＨＣｌ缓 冲 液 （５０
关键词：天冬酰胺酶；吴茱萸碱；纳米粒；药代动力学；生物利 用度；酶活性
与小分子化疗药相比，生物大分子药物如酶、抗 体等，具有特异性高和催化效力强的优点［１］。天冬 酰胺酶（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ，ＡＳＮａｓｅ）是一种自然界中广泛 分布的酶，其可以水解营养氨基酸天冬酰胺。在正 常细胞中，天冬酰胺是一种非必需氨基酸，细胞可以 通过自身的天冬酰胺合成酶合成天冬酰胺。然而， 肿瘤细胞只能依赖于血液循环中提供的天冬酰胺， ＡＳＮａｓｅ的使用会引起某些癌细胞的营养剥夺，从而 导致肿瘤细胞死亡［２］。目前，临床上主要将 ＡＳＮａｓｅ