RNA 沉默机制及其抗病毒应用
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2 反向重复序列转基因提高对相关病毒的 抗病性
研究者对发生 RNA 沉默的转基因植物的转基 因位点进行分析时发 现, RNA 沉默的 起始需要异 常 RNA 或 dsRNA 的参与, 且沉默过程常常与反向 重复的 DNA 片段的插入相关联[ 7] 。因此, 有研究 者提议可以将这种重复序列人为地引入转基因植 株, 来增强 RNA 沉默发生的概 率[ 15, 16] 。同样在转 基因抗病毒方面, 利用病毒基因组上基因的 cDNA 的反向重复片段转化植物, 通过启动 RNA 沉默机 制, 也得到了对相关病毒免疫的转基因植株[ 4, 17] 。
马铃薯 Y 病毒属( Potyvirus) 纤细病毒属( Tenuivirus)
南方菜豆金色花叶病毒属( Sobemovirus) 番茄丛矮病毒属( Tombusvirus) 番茄斑萎病毒属( Tospovirus)
抑制( Suppression)
完全( Complet e) 完全( Complet e) 完全( Complet e) 部分或系统( Partial syst emic)
有着密切的联系, 并就此提出了 RNA 介导抗病性 的概念。他们发现病毒侵染转基因植物后能够诱 导与入侵病毒同源的转基因的沉默, 并且沉默反应 总是与植物对病毒的恢复反应相伴。恢复反应是
指病毒侵染植 物后, 植物 新生的叶片不 表现出病 症, 也没有病毒粒子的积累, 并且对随后同源相关 病毒的挑战接种表现出高度抗性。随后 Dougherty 等[ 3] 和 Kalantidis 等[ 4] 发现导入病毒非翻译基因的 转基因植株也能提供高度的病毒抗性, 转基因病毒 RNA 量积累很低的转基因 植株, 能表 现出很高程 度的病毒抗性, 病毒 RNA 量积累很高的转基因植 株却表现出很低程度的病毒抗性。研究表明造成 上述现象的原因是在高抗( 或近似免疫) 的转基因 植株中, 转基因 RNA 在病毒入侵前, 就由于病毒转 基因自身诱发了 RNA 沉默机制, 而以序列特定性 的行为被降解了; 而在部分抗性的转基因植株中, 转基因 RNA 在病毒入 侵前不完全启动了 RNA 沉 默机制[ 4] 。
1 RNA 沉默与植物抗病毒特性
多少年来人们普遍认为转病毒基因植物所产 生的抗病性是由病毒基因所产生的蛋白质介导的。 但 1993 年 Lindbo 等[ 2] 却发现 RNA 沉默与植物病毒
收稿日期: 2003 09 12 修回日期: 2003 12 03 * 国家重点基础研究 发展规划 项目( G2000016204) 和教育 部高等 学校优秀青年教学科研奖励基金资助项目 * * 通讯作者, 电子信箱: zzhou@ zju. edu. cn
为了进一步证实 dsRNA 对 RNA 沉默的启动作 用, 人为地设计在转 基因植物内能 形成 dsRNA 的 反向重复序列转化植物或者直接向植物体内引入 dsRNA, 发现体内存在 dsRNA 的植株则表现出高度 的基因沉默。比如烟草中 79nt 的反向重复 ACC 氧 化酶序列可以有效地抑 制 ACC 氧 化酶的表达[7] ; 单独表达正义或反义的 PVY 蛋白酶( Pro) 基因的转 基因烟草对 PVY 没有抗性, 但是同时表达正义和 反义的 PVY Pro 基因的杂交烟草植株则对其产生 免疫; 而在矮牵牛中 CHS 的沉默也总是与 CHS 的 两个或更多 个转 基因 拷贝 的反 向重复 插入 相关 联[ 8] 。这些结果进一步证明 dsRNA 是基因沉默的 高效诱导因子。 1 2 21~ 23nt RNA 是 RNA 沉默的特异性决定因
码一个未知功能的蛋白; SDE3 在老鼠、果蝇和人中 编码的是一个类似于 RNA 螺旋酶的蛋白[ 13] 。这些
78
中 国生 物 工 程 杂 志
第 24 卷
基因突变都会导致植物的 RNA 沉默机制失活。在 植 物 体 内, SDE1 SGS2 和 SGS3 协 同 作 用 合 成 dsRNA [13] 。
在 RNA 沉默中, 也必须有一些酶的参与。参 与 RNA 沉默过程的重要酶类有三种: 依赖于 RNA 的 RNA 复 制 酶 ( RNA dependent RNA replicase, RdRp) 、RNA 解旋酶和核酸酶, 其中以 RdRp 最为引 人注目。对于侵染植物的病毒来说, 病毒含有依赖 于 RNA 的 RNA 复制酶, 它在病毒复制过程中能产 生 dsRNA 中 间 体; 而 转 基 因 植 物 中 所 形 成 的 dsRNA, 是由植物本身编码的 RdRp 造成的, 对拟南 芥突变体库的筛选表明植物本身确实存在类似于 RdRp 的 酶 类, 并 且 筛 选 到 了 多 个 沉 默 相 关 基 因[ 13] , 其中有三个基因已被克隆。SDE1 SGS2 编码 一种类 似于 RdRp 的 复制 酶[ 13] , QDE 1 是脉 胞菌 ( Neurospora) 引发基因沉默的必需基因[14] ; SGS3 编
表 1 病毒编码的 RNA 沉默抑制子 Table 1 RNA silencing suppressors encoded by viruses
病毒属( Genus)
菜豆金色花叶病毒属( Begomovirus) 大麦病毒属( Hordeivirus)
马铃薯卷叶病毒属( Polerovirus) 黄瓜花叶病毒属( Cucumovirus) 豇豆花叶病毒属( Comovirus) 花生皱丛簇病毒属( Pecluvirus) 马铃薯 X 病毒属( Potexvirus)
鉴于 RNA 沉默是植物本身固有的一种抗病毒 的防御机制, 侵染植物的病毒必需逃避或战胜植物 的 RNA 沉默防御机制, 才能完成它在寄主植物中 的侵染复制, 并进而完成对植物的成功侵染, 所以 某些植物病毒为了完成对植物的成功侵染, 对新的 寄主防卫反应产生适应性, 在进化过程中通过编码 一种蛋白( 病毒抑制子) 来抑制 RNA 沉默这一防御 机制, 如黄瓜花叶病毒( CMV) 2b 和马铃薯 Y 病毒 ( PVY) HC Pro 等。表 1 列出了迄今为止发现的含 有病毒抑制子的病毒及其某些重要特性[ 5] 。
RNAi 中也能够检测到[ 10] , 它们是与 RNA 诱导的沉 默复合体( RNA induced silencing complex, RISC) 一起 被分 离 出的[ 9] ; 在 果蝇 中, 21 ~ 23nt RNA 分 子为 RISC 诱导的同源、单链 RNA 分子降解所必需的, 并 且也足 以诱导 其降解[11] 。这 些事实 均表明 21~
部分( Part ial) 完全( Complet e) 部分或系统( Partial syst emic) 完全( Complet e) 完全( Complet e) 完全( Complet e) 完全( Complet e) 完全( Complet e)
蛋白( Protein)
AC2 b
P0 2b ? P15 P25 HcPro NS3 P1 P19 NSs
23nt RNA 是 RNA 沉 默 的 特 异 性 决 定 因 子。 Bernstein 等[ 12] 从 果 蝇 ( Drosophila ) 中 分 离 到一 种 Dicer 的关键酶, 它能在体外把 dsRNA 降解成能够 特异性攻击目标 mRNA 的 21~ 23nt RNAs, 而 Dicer 的缺失 突变 会减弱 果蝇引 发 RNAi 的能 力, 说明 Dicer 的确是催化切割 dsRNA 形成 21~ 23nt RNAs 的一个关键酶, 而 Dicer 的发现有力地支持 dsRNA 的确是在 Dicer 的催化下降解成 21~ 23nt RNAs。 1 3 参与 RNA 沉默的酶
RNA 沉默( RNA silencing) 是发生在真核生物细 胞中的一种对外源遗传因子的特异性和高效率的 降解 机 制。 该 现 象 最 早 在 转 查 尔 酮 合 酶 基 因 ( CH S) 的矮牵牛( Petunia) 中发现[ 1] , 随后在别的植 物和其他生物中, 都有关于 RNA 沉默的报道。起 初不同领域的研究者给它作了不同的命名: 植物学 家称它为共抑制( co suppression) 或转录后基因沉默 ( post transcriptional gene silencing, PTGS) ; 线虫 和果 蝇的研究人员称它为 RNA 干扰( RNAi) ; 真菌研究 者称它为消除作用( quelling) 。随着研究的深入, 研 究人员发现这些表面上看似不相关的现象, 其实都 是由同源的转基因、RNA 病毒和双链 RNA 等诱导 产生的一种特定序列的 RNA 降解机制, 其过程均 由沉默的启动、传导和保持三个阶段组成, 其作用 表现在抵御病毒、转座子等外来核酸入侵、识别并 抑制外源基因表达, 维持生物体基因组完整性。目 前, RNA 沉默与植物抗 病毒的关系已 引起了广泛 关注, 成为分子植物病毒学的研究热点。
第2 期
牛颜冰 等: RNA 沉默机制及其抗病wenku.baidu.com应用
77
病毒( Virus)
非洲木薯花叶病毒( ACMV ) 大麦条纹花叶病毒( BSMV) 甜菜西方黄花病 ( BWYV )
黄瓜花叶病毒( CMV ) 豇豆花叶病毒( CPMV) 花生皱丛簇病毒( PCV ) 马铃薯 X 病毒( PVX) 马铃薯 Y 病毒( PVY) 水稻白叶病毒( RHBV ) 水稻黄斑驳病毒( RYMV) 番茄丛矮病毒( TBSV ) 番茄斑萎病毒( TSWV)
子 在发生 RNA 沉默的转基因植物中存在着一定 数量 的 与 目 标 mRNA 高 度 同 源 的 21 ~ 23nt RNAs[ 9] 。如在表达 GFP 的马铃薯 X 病毒( PVX ) 载 体诱导 GFP 转基因植株发生 RNA 沉默时, 存在着 21~ 23nt RNA; 类似大小的 RNA 分子在动物执行
如何快速、高效地构建目标基因的反向重复序 列就成了当前利用 RNA 沉默机制获取对相关病毒 免疫的工程植株的关键步骤。Wesley 等[ 16] 就提出 了如何构建高效启动 RNA 沉默机制的反向重复序 列, 牛颜冰[17] 也为快速高效构建反向 重复序列提 出了可供研究者借鉴的方法。
1 1 dsRNA 对 RNA 沉默的启动 研究者们曾推测外源基因与植物内源基因因
同源 性 而 形 成 双 链 RNA ( double stranded RNA, dsRNA) 可能是 RNA 沉默的诱因, 但是一直无证据 支 持 这 一 观 点。 直 到 Fire 等[ 6] 将 小 杆 线 虫 ( Caenorhabditis elegans ) 内源 mex 3 的 dsRNA 注入 C . elegans 中, 并导致 C. elegans 内源的 mex 3 的转 录产物大幅度下降或消失, 才首次 证实 dsRNA 的 确是 RNA 沉默的诱导因子。
第 24 卷第 2 期
中 国生 物 工 程 杂 志
CHINA BIOTECHNOLOGY
2004 年 2 月
RNA 沉默机制及其抗病毒应用*
牛颜冰 青 玲 周雪平* *
( 浙江大学生物技术研究所 杭州 310029)
摘要 RNA 沉默是发生在植物( 转录后基因沉默或共抑制) 、动物( RNA 干扰) 和真菌( 消除作用) 等 真核生物细胞中的一种对外源遗传因子( 转座子、转基因或病毒) 的特异性和高效率的降解机制。 随着对植物病毒分子遗传学认识的加深和对寄主防御系统研究的深入, 发现了许多控制植物病毒 病的方法, 不过迄今为止最为成功的是通过 RNA 沉默机制获取抗病毒工程植株。在陈述了 RNA 沉 默机制的研究最新进展基础上, 提出了如何充分利用该机制进行植物抗病毒转基因研究。 关键词 RNA 沉默 植物抗病毒
RNA 沉 默 核 心 机制 共 分 为 3 个 主 要 步 骤: dsRNA 被 Dicer 降解成 21~ 23nt 的 RNA 分子; 通过 Dicer 与 RISC 中的蛋白结构域 PAZ 相互作用而将 21~ 23nt RNA 传递给 RISC 复合物; 在 RISC 的介导 下, 21~ 23nt RNA 对其目标 RNA 进行降解。
研究者对发生 RNA 沉默的转基因植物的转基 因位点进行分析时发 现, RNA 沉默的 起始需要异 常 RNA 或 dsRNA 的参与, 且沉默过程常常与反向 重复的 DNA 片段的插入相关联[ 7] 。因此, 有研究 者提议可以将这种重复序列人为地引入转基因植 株, 来增强 RNA 沉默发生的概 率[ 15, 16] 。同样在转 基因抗病毒方面, 利用病毒基因组上基因的 cDNA 的反向重复片段转化植物, 通过启动 RNA 沉默机 制, 也得到了对相关病毒免疫的转基因植株[ 4, 17] 。
马铃薯 Y 病毒属( Potyvirus) 纤细病毒属( Tenuivirus)
南方菜豆金色花叶病毒属( Sobemovirus) 番茄丛矮病毒属( Tombusvirus) 番茄斑萎病毒属( Tospovirus)
抑制( Suppression)
完全( Complet e) 完全( Complet e) 完全( Complet e) 部分或系统( Partial syst emic)
有着密切的联系, 并就此提出了 RNA 介导抗病性 的概念。他们发现病毒侵染转基因植物后能够诱 导与入侵病毒同源的转基因的沉默, 并且沉默反应 总是与植物对病毒的恢复反应相伴。恢复反应是
指病毒侵染植 物后, 植物 新生的叶片不 表现出病 症, 也没有病毒粒子的积累, 并且对随后同源相关 病毒的挑战接种表现出高度抗性。随后 Dougherty 等[ 3] 和 Kalantidis 等[ 4] 发现导入病毒非翻译基因的 转基因植株也能提供高度的病毒抗性, 转基因病毒 RNA 量积累很低的转基因 植株, 能表 现出很高程 度的病毒抗性, 病毒 RNA 量积累很高的转基因植 株却表现出很低程度的病毒抗性。研究表明造成 上述现象的原因是在高抗( 或近似免疫) 的转基因 植株中, 转基因 RNA 在病毒入侵前, 就由于病毒转 基因自身诱发了 RNA 沉默机制, 而以序列特定性 的行为被降解了; 而在部分抗性的转基因植株中, 转基因 RNA 在病毒入 侵前不完全启动了 RNA 沉 默机制[ 4] 。
1 RNA 沉默与植物抗病毒特性
多少年来人们普遍认为转病毒基因植物所产 生的抗病性是由病毒基因所产生的蛋白质介导的。 但 1993 年 Lindbo 等[ 2] 却发现 RNA 沉默与植物病毒
收稿日期: 2003 09 12 修回日期: 2003 12 03 * 国家重点基础研究 发展规划 项目( G2000016204) 和教育 部高等 学校优秀青年教学科研奖励基金资助项目 * * 通讯作者, 电子信箱: zzhou@ zju. edu. cn
为了进一步证实 dsRNA 对 RNA 沉默的启动作 用, 人为地设计在转 基因植物内能 形成 dsRNA 的 反向重复序列转化植物或者直接向植物体内引入 dsRNA, 发现体内存在 dsRNA 的植株则表现出高度 的基因沉默。比如烟草中 79nt 的反向重复 ACC 氧 化酶序列可以有效地抑 制 ACC 氧 化酶的表达[7] ; 单独表达正义或反义的 PVY 蛋白酶( Pro) 基因的转 基因烟草对 PVY 没有抗性, 但是同时表达正义和 反义的 PVY Pro 基因的杂交烟草植株则对其产生 免疫; 而在矮牵牛中 CHS 的沉默也总是与 CHS 的 两个或更多 个转 基因 拷贝 的反 向重复 插入 相关 联[ 8] 。这些结果进一步证明 dsRNA 是基因沉默的 高效诱导因子。 1 2 21~ 23nt RNA 是 RNA 沉默的特异性决定因
码一个未知功能的蛋白; SDE3 在老鼠、果蝇和人中 编码的是一个类似于 RNA 螺旋酶的蛋白[ 13] 。这些
78
中 国生 物 工 程 杂 志
第 24 卷
基因突变都会导致植物的 RNA 沉默机制失活。在 植 物 体 内, SDE1 SGS2 和 SGS3 协 同 作 用 合 成 dsRNA [13] 。
在 RNA 沉默中, 也必须有一些酶的参与。参 与 RNA 沉默过程的重要酶类有三种: 依赖于 RNA 的 RNA 复 制 酶 ( RNA dependent RNA replicase, RdRp) 、RNA 解旋酶和核酸酶, 其中以 RdRp 最为引 人注目。对于侵染植物的病毒来说, 病毒含有依赖 于 RNA 的 RNA 复制酶, 它在病毒复制过程中能产 生 dsRNA 中 间 体; 而 转 基 因 植 物 中 所 形 成 的 dsRNA, 是由植物本身编码的 RdRp 造成的, 对拟南 芥突变体库的筛选表明植物本身确实存在类似于 RdRp 的 酶 类, 并 且 筛 选 到 了 多 个 沉 默 相 关 基 因[ 13] , 其中有三个基因已被克隆。SDE1 SGS2 编码 一种类 似于 RdRp 的 复制 酶[ 13] , QDE 1 是脉 胞菌 ( Neurospora) 引发基因沉默的必需基因[14] ; SGS3 编
表 1 病毒编码的 RNA 沉默抑制子 Table 1 RNA silencing suppressors encoded by viruses
病毒属( Genus)
菜豆金色花叶病毒属( Begomovirus) 大麦病毒属( Hordeivirus)
马铃薯卷叶病毒属( Polerovirus) 黄瓜花叶病毒属( Cucumovirus) 豇豆花叶病毒属( Comovirus) 花生皱丛簇病毒属( Pecluvirus) 马铃薯 X 病毒属( Potexvirus)
鉴于 RNA 沉默是植物本身固有的一种抗病毒 的防御机制, 侵染植物的病毒必需逃避或战胜植物 的 RNA 沉默防御机制, 才能完成它在寄主植物中 的侵染复制, 并进而完成对植物的成功侵染, 所以 某些植物病毒为了完成对植物的成功侵染, 对新的 寄主防卫反应产生适应性, 在进化过程中通过编码 一种蛋白( 病毒抑制子) 来抑制 RNA 沉默这一防御 机制, 如黄瓜花叶病毒( CMV) 2b 和马铃薯 Y 病毒 ( PVY) HC Pro 等。表 1 列出了迄今为止发现的含 有病毒抑制子的病毒及其某些重要特性[ 5] 。
RNAi 中也能够检测到[ 10] , 它们是与 RNA 诱导的沉 默复合体( RNA induced silencing complex, RISC) 一起 被分 离 出的[ 9] ; 在 果蝇 中, 21 ~ 23nt RNA 分 子为 RISC 诱导的同源、单链 RNA 分子降解所必需的, 并 且也足 以诱导 其降解[11] 。这 些事实 均表明 21~
部分( Part ial) 完全( Complet e) 部分或系统( Partial syst emic) 完全( Complet e) 完全( Complet e) 完全( Complet e) 完全( Complet e) 完全( Complet e)
蛋白( Protein)
AC2 b
P0 2b ? P15 P25 HcPro NS3 P1 P19 NSs
23nt RNA 是 RNA 沉 默 的 特 异 性 决 定 因 子。 Bernstein 等[ 12] 从 果 蝇 ( Drosophila ) 中 分 离 到一 种 Dicer 的关键酶, 它能在体外把 dsRNA 降解成能够 特异性攻击目标 mRNA 的 21~ 23nt RNAs, 而 Dicer 的缺失 突变 会减弱 果蝇引 发 RNAi 的能 力, 说明 Dicer 的确是催化切割 dsRNA 形成 21~ 23nt RNAs 的一个关键酶, 而 Dicer 的发现有力地支持 dsRNA 的确是在 Dicer 的催化下降解成 21~ 23nt RNAs。 1 3 参与 RNA 沉默的酶
RNA 沉默( RNA silencing) 是发生在真核生物细 胞中的一种对外源遗传因子的特异性和高效率的 降解 机 制。 该 现 象 最 早 在 转 查 尔 酮 合 酶 基 因 ( CH S) 的矮牵牛( Petunia) 中发现[ 1] , 随后在别的植 物和其他生物中, 都有关于 RNA 沉默的报道。起 初不同领域的研究者给它作了不同的命名: 植物学 家称它为共抑制( co suppression) 或转录后基因沉默 ( post transcriptional gene silencing, PTGS) ; 线虫 和果 蝇的研究人员称它为 RNA 干扰( RNAi) ; 真菌研究 者称它为消除作用( quelling) 。随着研究的深入, 研 究人员发现这些表面上看似不相关的现象, 其实都 是由同源的转基因、RNA 病毒和双链 RNA 等诱导 产生的一种特定序列的 RNA 降解机制, 其过程均 由沉默的启动、传导和保持三个阶段组成, 其作用 表现在抵御病毒、转座子等外来核酸入侵、识别并 抑制外源基因表达, 维持生物体基因组完整性。目 前, RNA 沉默与植物抗 病毒的关系已 引起了广泛 关注, 成为分子植物病毒学的研究热点。
第2 期
牛颜冰 等: RNA 沉默机制及其抗病wenku.baidu.com应用
77
病毒( Virus)
非洲木薯花叶病毒( ACMV ) 大麦条纹花叶病毒( BSMV) 甜菜西方黄花病 ( BWYV )
黄瓜花叶病毒( CMV ) 豇豆花叶病毒( CPMV) 花生皱丛簇病毒( PCV ) 马铃薯 X 病毒( PVX) 马铃薯 Y 病毒( PVY) 水稻白叶病毒( RHBV ) 水稻黄斑驳病毒( RYMV) 番茄丛矮病毒( TBSV ) 番茄斑萎病毒( TSWV)
子 在发生 RNA 沉默的转基因植物中存在着一定 数量 的 与 目 标 mRNA 高 度 同 源 的 21 ~ 23nt RNAs[ 9] 。如在表达 GFP 的马铃薯 X 病毒( PVX ) 载 体诱导 GFP 转基因植株发生 RNA 沉默时, 存在着 21~ 23nt RNA; 类似大小的 RNA 分子在动物执行
如何快速、高效地构建目标基因的反向重复序 列就成了当前利用 RNA 沉默机制获取对相关病毒 免疫的工程植株的关键步骤。Wesley 等[ 16] 就提出 了如何构建高效启动 RNA 沉默机制的反向重复序 列, 牛颜冰[17] 也为快速高效构建反向 重复序列提 出了可供研究者借鉴的方法。
1 1 dsRNA 对 RNA 沉默的启动 研究者们曾推测外源基因与植物内源基因因
同源 性 而 形 成 双 链 RNA ( double stranded RNA, dsRNA) 可能是 RNA 沉默的诱因, 但是一直无证据 支 持 这 一 观 点。 直 到 Fire 等[ 6] 将 小 杆 线 虫 ( Caenorhabditis elegans ) 内源 mex 3 的 dsRNA 注入 C . elegans 中, 并导致 C. elegans 内源的 mex 3 的转 录产物大幅度下降或消失, 才首次 证实 dsRNA 的 确是 RNA 沉默的诱导因子。
第 24 卷第 2 期
中 国生 物 工 程 杂 志
CHINA BIOTECHNOLOGY
2004 年 2 月
RNA 沉默机制及其抗病毒应用*
牛颜冰 青 玲 周雪平* *
( 浙江大学生物技术研究所 杭州 310029)
摘要 RNA 沉默是发生在植物( 转录后基因沉默或共抑制) 、动物( RNA 干扰) 和真菌( 消除作用) 等 真核生物细胞中的一种对外源遗传因子( 转座子、转基因或病毒) 的特异性和高效率的降解机制。 随着对植物病毒分子遗传学认识的加深和对寄主防御系统研究的深入, 发现了许多控制植物病毒 病的方法, 不过迄今为止最为成功的是通过 RNA 沉默机制获取抗病毒工程植株。在陈述了 RNA 沉 默机制的研究最新进展基础上, 提出了如何充分利用该机制进行植物抗病毒转基因研究。 关键词 RNA 沉默 植物抗病毒
RNA 沉 默 核 心 机制 共 分 为 3 个 主 要 步 骤: dsRNA 被 Dicer 降解成 21~ 23nt 的 RNA 分子; 通过 Dicer 与 RISC 中的蛋白结构域 PAZ 相互作用而将 21~ 23nt RNA 传递给 RISC 复合物; 在 RISC 的介导 下, 21~ 23nt RNA 对其目标 RNA 进行降解。