基因沉默与RNAi技术

基因沉默与RNAi技术

定义：基因沉默双是指链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。

RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由双链引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。

基因沉默是一种RNA干扰技术。

RNA干扰是由双链RNA 引发的转录后基因静默机制。其原理是：RNaseIII核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21 - 25nt及3'端突出的小干扰RNA (small interfering RNA

，siRNA)，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA - induced silencing complex

，RISC结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制.

一、基因沉默的分类及其机制

（一）转录水平基因沉默

转录水平基因沉默是指对基因专一的细胞核

ＲＮＡ合成的失活，

它的发生主要是由于基因无法被顺利转录成相应的ＲＮＡ而导致基因沉默。转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种：

１．基因及其启动子甲基化

甲基化是活体细胞中最常见的一种ＤＮＡ共价修饰形式，通常发生在ＤＮＡ的ＣＧ序列的碱基上，该区碱基甲基化往往导致转录受抑制，该区甲基化的频率

在人类及高等植物中分别可达４％和３６％。［４］

近来的研究表明，发生在转基因启动子５’端的甲基化是造成转录水平基因沉默的主要原因。虽然转基因的甲基化可延伸至转基因的３’端，但甲基化过程均是从启动子区域开始的。从所报道的转基因沉默例子来看，几乎所有的转基因沉默现象与转基因及其启动子的甲基化有关。

２．同源基因间的反式失活

反式失活主要是由于拥有同源序列的沉默位点和其他位点的ＤＮＡ的相互作用而引起的基因沉默。通过顺式作用而甲基化并失活的基因能作为一种“沉默子”，对其他与之分离的具有同源性的靶基因施加一种反式作用，使具有同源序列的靶基因发生甲基化并导致失活。反式失活的靶基因既可以与沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。

３．后成修饰作用导致的基因沉默

后成修饰作用是指转基因的序列和碱基组成不发生改变，但是其功能却在个体发育的某一阶段受到细胞内因子的修饰作用后而关闭。这种修饰作用所造成的转基因沉默是可以随着修饰作用的解除而被消除。后成修饰作用导致的转基因沉默与

受体植物的核型构成有关。

４．重复序列

外源基因如果以多拷贝形式整合到同一位点上，形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重复，则不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这种重复序列诱导的基因沉默与在真菌中发现的重复序列诱导的点突变相类似，均可能是重复序列间自发配对，甲基化酶特异性识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑制其表达。

５．位置效应

位置效应是指基因在基因组中的位置对其表达的影响。当外源基因整合到高度甲基化、转录活性低的异染色质区域时，外源基因一般表现沉默，这说明毗邻ＤＮＡ的甲基化和异染色质化对插入的外源基因影响很大，可能导致外源基因在转录水平上失活。如果转基因插入转录不活跃区域或异染色质区域，转基因通常会融人该区域的染色质结构，使转基因进行很低水平的转录，或使转基因发生异染色质化而导致转基因沉默。

（二）转录后水平基因沉默

转录后水平基因沉默是指基因在细胞核内能稳定转录，但在细胞质里却无相应稳定态ｍＲＮＡ存在的

现象。与转录水平基因沉默不同，转录后水平基因沉默具有逆转性，即受抑制基因通过减数分裂可以恢复表达活性，表现为减数分裂不可遗传性。目前发现主要有以下几种转录后水平基因沉默现象。

１．共抑制

共抑制是最常见的转录后水平基因沉默。这一现象首先由Ｎａｐｏｌｉ在转ＣＨＳ基因的矮牵牛花中发现。共抑制现象普遍存在于转基因植物中。共抑制的发生是由于外源基因编码区与受体细胞基因间存在同源性而导致外源基因与内源基因的表达同时受到抑制。具有同源性的外基因和内源基因在细胞核内的转录速率很高，但在细胞质内无ｍＲＮＡ积累，是典型的转录后水平基因沉默。若导入的外源基因与内源基因无序列同源性，外源基因自身也常常会发生转录后水平基因沉默。有关研究发现，共抑制的产生不仅同内、外源基因间编码区的同源性有关，还与控制外源基因的启动子的强度等因素有关。

２．基因压制

Ｃｏｇｏｎｉ等在粗糙脉抱霉的转化实验中发现，外源基因可以抑制自身和相应内源基因的表达，他们把这一现象定为基因压制。Ｃｏｇｏｎｉ等是以类胡萝卜素生物合成基因ａｌｂｉｎｏ－１作为视觉报道基因来研究基因压制的。他们发现，基因压制是可逆的，而且这种逆转会伴随有外源拷贝的丢失。基因压制发生在转录后水平，导致已复制的稳定态ｍＲＮＡ大量减少。

３．ＲＮＡ干扰ＲＮＡ干扰是１９９８年Ｆｉｒｅ首次在秀丽线虫中发现

并证明属于转录后水平的基因沉默。

利用小片段双链ＲＮＡ可以特异性地降解相应序列的ｍＲＮＡ，从而特异性地阻断相应基因的表达。ＲＮＡ干扰广泛存在于从真菌到植物、从无脊椎动物到哺乳动物的各种生物中。ＲＮＡｉ的作用机制目前尚不完全清楚，学者们在线虫、果蝇、植物和动物卵细胞的ＲＮＡｉ实验中，最近相继发现了一些与ＲＮＡｉ作用相关的酶和蛋白，如ｄｓＲ－ＮＡ特异性核酸内切酶、ＲＮＡ依赖性ＲＮＡ聚合酶、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白等。

现已初步阐明ＲＮＡｉ的作用机制如下：各种ｄｓＲＮＡ通过各种转染技术转入