人工微RNA定向基因沉默

人工miRNA定向基因沉默

摘要：描述一个基因的功能通常包括对功能丧失等位基因的详细的分析。在模式植物例如拟

南芥和水稻中，插入序列索引的收集为潜在无效等位基因分析提供了很大帮助，而这些都可以

通过网站(e.g., )容易的获取。然而，这对于非模式生物是不可能的，要研

究非模式生物，需要敲除大量的同系物，而且部分缺失基因功能或者调节缺失基因功能不容易

应用，然而当无效等位基因是致死的时，这种方法却很有效。采用定向基因沉默技术的转基因

途径可以替换无效等位基因，也可以用于基因功能的精细研究，例如，通过组织特异性的和可

诱导的基因沉默。

这一章将阐述人工miRNA的产生以及人工miRNA(amiRNAs)作为基因沉默工具在不同植物定向 1.六寡核苷酸：两个是对载体普遍的（A 和B，表一），四个是特异修饰的。

它们的序列是amiRNA设计程序的输出结果。

2．模板质粒：PRS300（包括Arabidopsis athMIR319a）或者PNW55（包括水

稻osa-MIR528）

3.进行PCR，琼脂糖凝胶电泳，以及凝胶提取所需的装置和化学试剂。

图三，构建amiRNA前体的模版质粒——aMIRNA。（a）Plasmid pRS300包含pBluescript SK中的osa-MIR528前体（通过SmaI位点克隆）。（b）质粒pNW55包含pBluescript KS中的osa-MIR528前体（也是通过SmaI克隆）。质粒全部序列是在http://wmd3. .可获取的。缩写：A,B,寡核苷酸结核位点；T3，T7 ：RNA聚合酶/寡核苷酸结合位点；Amp:氨苄青霉素抗性基因；MCS:多克隆位点。aMIRNA的大小和围绕区域在图四中指示。

图四，图示产生aMIRNA前体的PCR反应。（a）为有寡核苷酸结合位点的模版质粒（图三）；（b）PCR扩增（a）（b）（c）,（c）（a）（b）（c）通过PCR融合产生（d）(d)只有中央部分编码aMIRNA 前体，在底部的图中已列出。缩写：Ath：拟南芥；Osa：栽培稻；A, B, I, II, III, IV：寡核苷酸识别物；MCS：多克隆位点；a), (b), (c), (d)：PCR片段。

3.2.2寡核苷酸要产生一个aMIRNA的转基因，需要六个PCR寡核苷酸引物。四个引物

叠aMIRNA 1.在接受之后暂停模板质粒，然后转到有活力的E. coli 细胞中（标准实验株）。再将细胞铺到含有青霉素的LB 平板上，然后挑取单个菌落上的菌培养过夜，最后用标准的质粒分离操作分离质粒。准备一个1：100的稀释。

2.设置PCR 反应（a ）—（c ）。

所有PCR 反应都应该优先考虑用有校正功能的聚合酶（例如pfu ）来避

免出错。表2展示了每个PCR 反应的寡核苷酸复合物及其产物的预期大小。

（图3也可参看）

3.用2%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR 片段并用标准的凝胶提取操作纯化。来

自反应（a ）（b ）（c ）PCR 片段已经在这步操作中混合了，用20ul 水洗脱下

来。

4.反应（d ）:把片段(a)(b)(c)融合。

5. 从

1%的琼脂糖凝胶中分离PCR 片段 为了从序列上证实融合-PCR 的产物，它可以通过平末端连接到标准载体

用套件或者行(参看笔记5了解Gateway 兼容载体的使用)

有校对聚合酶的PCR 反应产生平末端产物。有的公司也提供能够直接克隆平末端DNA 片段的套件(例如Invitrogen 公司的TOPO 套件)，它的使用方

法则参照厂商的说明书。另外的简单而又便宜的克隆平末端PCR 产物的工具

则是基于线性化的质粒，这种质粒通过能产生平末端的限制酶使其线性化

（例如SmaI ）。因为PCR 产物的5’端未磷酸化，因此质粒在限制酶酶切后

需要保留末端的磷酸基团，且可直接用于连接而不需要预先的磷酸化或纯

化。空载质粒的连接的重新连接被额外加到连接混合物中的SmaI 阻止。

在转入合适的标准大肠杆菌株之前，将连接混合物在16℃保温过夜，然

后30℃（SmaI 的最适温度）保温2h 。如果可能的话，可通过蓝白斑实验检

测目标片段是否插入。单独的菌落被培养，在用标准寡核苷酸（与质粒有关）

或是寡核苷酸A/B 测序前，发生回复的质粒DNA 应用酶水解(例如，用EcoRI

和BamHI 酶解可产生一个408bp 带有ath-MIR319a ，和一个268bp 带有

osa-MIR528的模板)。这里测序的目的是确定新的质粒确实已改变。如果知

道质粒上有独特的限制位点将对实验很有帮助——pRS300 (ath-MIR319a)上

参考文献

1. Chapman EJ, Carrington JC (2007) Specia-zation and evolution of endogenous small RNA pathways. Nat Rev Genet 8:884–896

2. Tang G, Galili G, Zhuang X (2007) RNAi and microRNA: breakthrough technologies for the improvement of plant nutritional value and metabolic engineering. Metabolomics 3:357–369

3. Allen E, Xie Z, Gustafson AM, Carrington JC (2005) MicroRNA-directed phasing during trans-acting siRNA biogenesis in plants. Cell 121:207–221

4. Schwab R, Ossowski S, Riester M, Warthmann N, Weigel D (2006) Highly specific gene silenc-ing by artificial microRNAs in Arabidopsis. Plant Cell 18:1121–1133

5. Schwab R, Palatnik JF, Riester M, Schommer C, Schmid M, Weigel D (2005) Specific effects of microRNAs on the plant transcriptome. Dev Cell 8:517–527

6. Ossowski O, Schwab R, Weigel D (2008) Gene silencing in plants using artificial microRNAs and other small RNAs. Plant J 53(4):674–690

7. Vaucheret H (2005) MicroRNA-dependent trans-acting siRNA production. Sci STKE 2005:pe43

8. Alvarez JP, Pekker I, Goldshmidt A, Blum E, Amsellem Z, Eshed Y (2006) Endogenous and synthetic microRNAs stimulate simultaneous, efficient, and localized regulation of multiple targets in diverse species. Plant Cell 18:1134–1151

9. Niu QW, Lin SS, Reyes JL et al (2006) Expression of artificial microRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance. Nat Biotechnol 24:1420–1428

10. Parizotto EA, Dunoyer P, Rahm N, Himber C, Voinnet O (2004) In vivo investigation of the transcription, processing, endonucleolytic activity, and functional relevance of the spatial distribution of a plant miRNA. Genes Dev 18:2237–2242

11. Qu J, Ye J, Fang R (2007) Artificial miRNA mediated virus resistance in plants. J Virol 81(12):6690–6699

12. Warthmann N, Chen H, Ossowski O, Weigel D, Hervé P. Highly Specific Gene Silencing by Artificial miRNAs in Rice. submitted.

13. Michniewicz M, Zago MK, Abas L et al (2007) Antagonistic regulation of PIN phosphorylation by PP2A and PINOID directs auxin flux. Cell 130:1044–1056

14. Palatnik JF, Allen E, Wu X et al (2003) Control of leaf morphogenesis by microRNAs. Nature 425:257–263

15. Abouelhoda MI, Kurtz S, Ohlebusch E (2004) Replacing suffix trees with enhanced suffix arrays. Journal of Discrete Algorithms 2:53–86