基因沉默与RNAi技术
rnai技术原理
rnai技术原理RNAi技术原理。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种特殊的基因沉默技术，通过特异性降解靶基因的mRNA，从而抑制靶基因的表达。
RNAi技术被广泛应用于基因功能研究、疾病治疗和农业生物技术等领域。
本文将介绍RNAi技术的原理及其在生物学研究中的应用。
RNAi技术的原理主要包括三个步骤，siRNA合成、RNA诱导靶基因沉默和RNA诱导沉默的效应。
首先，siRNA由外源DNA转录而来，或由细胞内Dicer酶切割长双链RNA产生。
siRNA由RISC复合物识别并结合，导致RISC复合物介导的靶基因mRNA降解。
最终，靶基因的表达被抑制，从而实现基因沉默的效果。
RNAi技术在基因功能研究中有着广泛的应用。
通过合成siRNA，研究人员可以选择性地沉默感兴趣的基因，从而研究其功能。
利用RNAi技术，研究人员可以验证基因的功能、探索信号通路、筛选药物靶点等。
此外，RNAi技术还被应用于疾病治疗领域。
通过设计siRNA靶向疾病相关基因的mRNA，可以实现对疾病基因的特异性沉默，为基因治疗提供了新的途径。
除此之外，RNAi技术还在农业生物技术领域发挥着重要作用。
利用RNAi技术，可以设计siRNA靶向害虫或病原体的基因，从而实现对害虫或病原体的生物防治。
此外，RNAi技术还可以用于改良作物品质、提高作物产量等方面。
综上所述，RNAi技术作为一种重要的基因沉默技术，具有广泛的应用前景。
通过深入理解RNAi技术的原理，研究人员可以更好地利用这一技术，推动基因功能研究、疾病治疗和农业生物技术等领域的发展。
RNAi技术的不断创新和应用将为生命科学领域带来更多的突破和进展。
RNAi技术和基因沉默的机制和应用
RNAi技术和基因沉默的机制和应用RNA干扰技术（RNAi）是一种广泛适用于生物科学研究的技术。
它是通过引导小分子RNA介导的基因沉默来抑制基因表达。
RNAi技术最初在植物和昆虫中被发现，但现在已广泛用于哺乳动物和人类细胞和组织中的基因表达调控研究。
在本文中，我们将讨论RNAi技术和基因沉默的原理、机制和应用。
RNAi的基本原理RNAi技术利用RNA分子的寡核苷酸（siRNA）或小干扰RNA （shRNA）来干扰基因的表达。
siRNA是由RNA分子降解酶Dicer切割长双链RNA产生的。
shRNA则是由人工合成的RNA分子。
在细胞内，siRNA或shRNA与蛋白质复合物RISC结合并介导基因沉默。
RNAi可以通过两种方式干扰基因表达。
第一种方式是RNA干扰（post-transcriptional gene silencing，PTGS），其作用在转录后RNA分子级别，导致RNA分子的降解或翻译受阻。
第二种方式是基因组学RNAi（simultaneous silencing of multiple genes，SSMG），其作用在基因组水平，导致染色体的某一区域沉默，从而抑制基因的表达。
RNAi的分子机理RNAi的分子机理是一系列复杂的分子事件。
RNAi起始于RNA分子的降解过程。
在细胞内，RNA分子通过RNA聚合酶复制DNA成为mRNA，而mRNA分子则被转录成蛋白质。
RNAi的分子机理是通过RNA分子的降解来干扰基因的表达。
RNA分子的降解分为两个步骤：第一个是dsRNA（双链RNA）的特异酶Dicer的作用分解成siRNA。
第二步骤是siRNA与RISC（RNA诱导的沉默复合物）结合，选择性攻击与siRNA相同序列的mRNA分子，导致mRNA分子的降解或翻译受阻。
这个过程在细胞中形成一个自停反馈回路，使得RNAi可以快速响应和调节基因表达。
RNAi的应用RNAi技术已广泛应用于生物医学研究中的基因调控和治疗。
基因沉默的技巧
基因沉默的技巧基因沉默是一种控制基因表达的方法，通过阻断特定基因的转录或翻译过程来抑制基因的功能。
这项技术可以帮助我们研究基因的功能以及疾病的发生机制，并且可以在基因治疗和生物工程中应用。
基因沉默的技巧主要有两种：RNA干扰（RNA interference，RNAi）和CRISPR/Cas9。
下面将详细介绍这两种技术及其应用。
1. RNA干扰（RNAi）：RNA干扰是一种通过RNA分子的相互作用来抑制特定基因表达的技术。
它利用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）或microRNA（miRNA）与靶基因的mRNA结合，形成双链RNA复合体，在细胞内启动RNA降解机制，降解靶基因的mRNA，从而阻断靶基因的转录和翻译。
在实验室中，研究者可以合成特定靶向基因的siRNA或miRNA，并将其转染入细胞中。
为了提高转染效率，研究者通常会使用载体或转染试剂，帮助siRNA 或miRNA进入细胞内。
RNA干扰技术的优点是简便易行、基因特异性高，可以在多种细胞类型中应用，而不仅限于哺乳动物细胞。
在生物医学研究中，RNA干扰技术被广泛应用于基因功能研究、基因治疗、疾病模型的建立等方面。
通过沉默特定基因，研究者可以研究该基因的功能以及与其相关的信号通路；通过沉默病理基因，研究者可以评估基因治疗的潜力，并寻找治疗疾病的新靶点。
2. CRISPR/Cas9：CRISPR/Cas9是一种基因组编辑技术，也可以用于基因沉默。
它利用Cas9蛋白与特定的导向RNA（gRNA）形成复合物，通过与靶基因的DNA序列互补配对，引导Cas9蛋白在特定位点上切割DNA，导致DNA双链断裂。
然后细胞内的修复机制会修复该断裂，并可能导致基因沉默。
CRISPR/Cas9技术的优点是高效、精准、灵活，并且可以在多种生物体内应用。
研究者可以设计特定的gRNA，使其与靶基因的DNA序列完全互补配对，从而实现对该靶基因的沉默。
第四章 RNAi 与基因沉默
Phenomena first observed in petunia
Attempted to overexpress chalone synthase (anthrocyanin pigment gene) in petunia. (trying to darken flower color) Caused the loss of pigment.
Tissue specific
构建表达shRNA的质粒载体
编码多个shRNAs质粒表达载体
有公司近期又推出专利产品：一个载体编码6个 shRNA的构建服务，可以同时封闭2个以上的目标基 因了。 晶赛公司同时推出编码shRNA（1-6个）并表达La 蛋白的载体构建服务（根据已发表文献，La蛋白与 siRNA干扰目标基因效果密切相关。如果La蛋白低 下，siRNA效果低下甚至无效。）。
基因沉默与RNA干扰技术
RNA interference (RNAi)
2006：Silence is golden. Andrew Fire (left) and Craig Mello learned that they'd won the Nobel Prize for their groundbreaking discovery of RNAi's gene-quelling power.
RNA interference – Mechanism
DICER - RNAse III, ds spec. endonuclease - Dimer, 2 catal. domains, helicase
酶
and PAZ motif - produce 2-3nt 3´overhangs - ATP-dependent ribonuclease
RNAi基因沉默机制
线虫体内的RNAi
• 线虫中RNAi效应的检测 • （左面）两条线虫表现为绿色荧光蛋白（GFP）表达类型品系，该 品系含有一个普遍性表达的GFP报告基因重组质粒（带有核内定位 信号位点）。 • （右面）喂食表达针对GFP的dsRNA的细菌后，整个虫体的GFP信 号消失。
RNAi机制示意图
RNAi相关的基因沉默通路示意
RNAi的定义 • 目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种， 不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将 RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义： • ① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性 基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水 平上阻断基因的表达。 • ② RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源 mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸 序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入 或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同 源的基因发生共同基因沉默的现象。
牵牛花中dsRNA介导查耳酮基因沉默模式
RNAi应答的基本特征 • 1 靶基因内源性序列不发生改变。 • 2 细胞质中靶mRNA水平下降，但细胞核的 mRNA前体数量未受影响。 • 3 每个细胞仅需要少量分子就可对大量 mRNA发挥作用，提示存在某些放大 和/或 催化活性在起作用。 • 4 RNAi效应可以在线虫体内传播。
RNA干扰(RNA interference，erference, RNAi) 是真核生物 中的一种普遍现象，它在很多不同的生物过程中起 到非常重要的作用。这些过程包括发育调控，抵抗 病毒侵染，以及染色质修饰。RNAi的重要特征包 括Dicer切割产生小分子RNA和RNA诱导的沉默结 合(RNAinduced silencing complex, RISC)的 形成。RISC可以导致转录或转录后水平的基因沉 默。在植物中存在至少三种RNAi通路，这包括 siRNA介导的转录后水平的基因沉默，miRNA介 导的切割或翻译抑制和转录水平的基因沉默。转录 水平的基因沉默通常与染色质的修饰（DNA和 histone的甲基化）紧密相关。
基因沉默的原理及应用
基因沉默的原理及应用一、基因沉默的原理基因沉默是指通过RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）技术，特异性地抑制特定基因的表达。
基因沉默在生物学研究中具有重要的应用价值，其原理主要包括以下几个方面：1. siRNA的合成与靶向短干扰RNA（short interfering RNA，简称siRNA）是基因沉默的关键分子。
在细胞内，siRNA会与RNA诱导靶向耗竭（RNA-induced silencing complex，简称RISC）结合，形成RNA-蛋白复合体，然后通过匹配特定序列，将复合体定位到目标mRNA上，最终导致mRNA降解、剪接或抑制翻译。
2. miRNA的生成和功能微小RNA（microRNA，简称miRNA）是一类长度约为21-23个核苷酸的非编码RNA分子。
miRNA产生于细胞内，通过与RNA诱导靶向耗竭结合，实现对mRNA的调控。
miRNA主要通过与mRNA的3’非翻译区域互补配对，诱导mRNA的降解或抑制翻译，从而实现目标基因的沉默。
3. RISC的功能和调控RISC是RNA干扰过程中的一个重要复合体，其主要成员包括siRNA或miRNA，以及相关的蛋白质。
RISC在基因沉默中起到关键的作用，通过与靶向RNA结合，实现对mRNA的调控。
RISC中的蛋白质能够辅助siRNA或miRNA与靶向RNA的杂交，并促进靶向RNA的降解或抑制翻译。
二、基因沉默的应用基因沉默技术已经在许多领域展现出广阔的应用前景，一些典型的应用包括：1. 研究基因功能基因沉默可以通过抑制特定基因的表达，来研究该基因在生物体中的功能。
通过沉默特定基因后，研究人员可以观察到沉默基因对生物体的影响，从而揭示出特定基因在生物体发育、代谢、免疫等方面的作用，为相关研究提供有力的证据。
2. 治疗基因相关疾病基因沉默技术在治疗基因相关疾病方面具有巨大的潜力。
通过针对病因基因进行沉默，可以有效地抑制病因表达，从而达到治疗目的。
基因沉默和RNAi技术
基因沉默与RNAi技术定义：基因沉默双是指链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA 与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。
RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。
由双链引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。
有时转基因会同时导致TGS和PTGS。
基因沉默是一种RNA干扰技术。
RNA干扰是由双链RNA 引发的转录后基因静默机制。
其原理是：RNaseIII核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21 - 25nt及3'端突出的小干扰RNA (small interfering RNA ，siRNA)，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA - induced silencing complex，RISC结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制.一、基因沉默的分类及其机制（一）转录水平基因沉默转录水平基因沉默是指对基因专一的细胞核ＲＮＡ合成的失活，它的发生主要是由于基因无法被顺利转录成相应的ＲＮＡ而导致基因沉默。
转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。
引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种：１．基因及其启动子甲基化甲基化是活体细胞中最常见的一种ＤＮＡ共价修饰形式，通常发生在ＤＮＡ的ＣＧ序列的碱基上，该区碱基甲基化往往导致转录受抑制，该区甲基化的频率在人类及高等植物中分别可达４％和３６％。
［４］近来的研究表明，发生在转基因启动子５'端的甲基化是造成转录水平基因沉默的主要原因。
vigs基因沉默原理和rnai沉默
vigs基因沉默原理和rnai沉默VIGS基因沉默原理和RNAi沉默是两种常用的分子生物学技术，被广泛应用于研究植物基因功能。
它们有些相似之处，同时也存在一些差异。
本文将对这两种技术的原理、应用和优缺点进行详细探讨。
1. VIGS基因沉默原理VIGS（Virus-induced gene silencing）是通过病毒侵染植物细胞，诱导宿主植物基因的沉默。
该技术利用了病毒的复制和传播机制，将目标基因序列整合到病毒基因组中，并且在感染的植物细胞中产生可复制的RNA介导的沉默效应。
具体步骤包括：（1）构建VIGS载体：将目标基因的部分序列插入病毒载体，形成VIGS载体。
（2）VIGS载体侵染植物细胞：将构建好的VIGS载体导入病毒感受性植物中，让病毒基因组中的目标基因RNA与宿主植物基因的mRNA互补杂交，导致宿主基因沉默。
（3）基因沉默效应：病毒RNA会在植物细胞中被RNA依赖性RNA 聚合酶复制成多个复制体，随后通过系统性运输到植物全身，触发整个植物的基因沉默效应。
2. RNAi基因沉默原理RNA干扰（RNA interference）是一种保守的基因沉默机制，通过切割目标mRNA分子而将其降解，从而实现对基因表达的调控。
RNAi主要通过siRNA和miRNA两条途径实现。
具体步骤包括：（1）siRNA的产生：长双链RNA被核酸酶Dicer切割成短双链siRNA。
（2）siRNA的介导：siRNA将RISC（RNA诱导的沉默复合体）导入到靶基因mRNA上，使其降解。
（3）miRNA的产生：由miRNA基因转录出的pri-miRNA在细胞核中被核酸酶Drosha切割为pre-miRNA，经过转运到细胞质后被Dicer 进一步切割成短miRNA。
（4）miRNA的介导：miRNA与RISC结合后能够通过完全或不完全互补靶序列的mRNA上结合，从而通过诱导转录后调控蛋白质的翻译或降解。
3. VIGS和RNAi的异同点（1）机制差异：VIGS是依赖于病毒的复制和传播来诱导植物基因沉默，而RNAi是通过siRNA和miRNA介导的沉默机制来调控基因表达。
vigs基因沉默原理和rnai沉默
vigs基因沉默原理和rnai沉默VIGS（Virus-induced gene silencing）基因沉默和RNAi（RNA interference）沉默都是生物学研究中常用的方法，用于研究基因的功能和调控机制。
它们共同的原理是通过引入相应的外源RNA分子来诱导靶基因（target gene）的沉默，从而研究基因在细胞与整个生物体中的功能。
虽然二者的原理有所不同，但它们在生物学研究中都发挥着重要作用。
VIGS（Virus-induced gene silencing）基因沉默是通过利用病毒来传递RNA分子，并引发对应的基因沉默的一种方法。
这种方法最早是在植物领域中发现的，后来也在许多其他生物中得到应用。
VIGS 的基本原理是通过将目标基因片段插入表达病毒载体中，然后通过病毒感染植物或动物细胞，利用病毒的复制过程来产生RNA分子，从而导致目标基因的沉默。
这种沉默通常是由于RNA分子通过切割或RNA-DNA相互作用等机制，导致目标基因的mRNA降解，或抑制其翻译成蛋白质，从而实现基因沉默的目的。
相比之下，RNAi是一种借助内源的RNA分子来诱导基因沉默的方法。
它是由一种特殊的RNA分子，即小干扰RNA（siRNA）和微小内源RNA（miRNA）介导的细胞内调控机制。
这些RNA分子通常由一类酶称为Dicer切割出来，该酶能够将双链RNA分子切割成约20-25个碱基对（bp）长度的小分子RNA。
这些小RNA分子与靶基因的mRNA结合，并通过RNA诱导的合成酶（RISC）复合物的作用，将靶基因的mRNA切割成短片段，从而抑制目标基因的翻译过程，实现基因沉默。
不同于VIGS基因沉默方式，RNAi机制更加普遍，并广泛存在于真核生物细胞中。
VIGS和RNAi基因沉默技术在生物学研究中的应用非常广泛。
通过利用这些技术，研究人员可以选择特定的靶基因，并通过适当设计的RNA分子来诱导其沉默。
这些研究通常通过研究目标基因沉默后的表型变化来揭示基因的功能和调控机制。
基因沉默和RNAi在基因表达和表观遗传调控中的作用研究
基因沉默和RNAi在基因表达和表观遗传调控中的作用研究基因是生命的基础，它通过蛋白质的合成来实现生命活动。
但是，不同的基因在不同的细胞类型或生命阶段中会表现出不同的表达模式。
这是因为基因表达受多个因素的综合调控，包括基因组DNA序列的编码性和非编码性区域、细胞内转录和翻译的调控机制等。
在过去的几十年中，发现了许多基因表达调控的机制，其中最为重要的是基因沉默和RNA干扰(RNAi)。
这两种调控机制既有相似之处，又有不同之处。
下面我们分别来看这两种调控机制的特点及其作用。
一、基因沉默基因沉默是指在基因组中存在一些序列，它们能够对特定的基因表达进行负面调控。
在哺乳动物细胞中，基因沉默主要通过DNA甲基化和组蛋白修饰来实现。
DNA甲基化指的是在DNA分子中，甲基化酶会在特定的CpG位点上附加一个甲基基团，从而改变基因的表达，使其被某些转录因子所识别(或不能识别)。
组蛋白修饰则指细胞能够将组蛋白进行不同类型的化学修饰，如甲基化、磷酸化等，这些修饰改变了组蛋白与DNA结合的性质，导致基因表达的改变。
基因沉默的重要性越来越受到人们的关注。
例如，研究表明在发育过程中，基因沉默可能对细胞类型分化产生了一定的影响。
此外，基因沉默还能够对人体疾病的发生和进展产生影响。
例如，某些肿瘤就会因为基因的沉默而无法被免疫系统识别和消除。
二、RNA干扰RNA干扰是指RNA分子在细胞内调节基因表达的过程。
它主要分为两种类型：siRNA和miRNA。
其中siRNA是双链RNA分子，能够针对外源性RNA序列或某些特定的内源性基因RNA进行剪切，从而降低它们的表达。
而miRNA则是单链RNA分子，能够与靶基因mRNA分子形成互补，从而阻止它们翻译为蛋白质。
与基因沉默不同，RNA干扰是通过RNA分子在细胞中的作用来调节基因表达的。
RNA干扰的发现，极大地推动了人们对基因表达调节机制的研究。
从此以后，RNA干扰就成为了基因功能研究中的一个重要手段。
基因沉默技术的原理及应用
基因沉默技术的原理及应用1. 引言基因沉默技术是一种用于研究基因功能和调控机制的重要方法。
它能够通过抑制特定基因的表达来观察其对细胞和生物体的影响，为我们揭示基因在生物体内的功能和相互作用提供了有效的手段。
本文将介绍基因沉默技术的原理以及其在基础研究和应用方面的相关实验技术。
2. 基因沉默技术的原理基因沉默技术主要通过RNA干扰（RNA interference，RNAi）和基因编辑技术实现。
以下将分别介绍这两种技术的原理。
2.1 RNA干扰（RNAi）RNA干扰是一种通过介导RNA分子与特定的mRNA相互作用来沉默目标基因表达的方式。
其基本原理是通过引入双链RNA（dsRNA）或小干扰RNA（siRNA）分子，利用细胞内的RNA诱导酶（RNA-induced silencing complex，RISC）将这些RNA分子切割成小片段，并通过与靶标mRNA互补序列的结合，诱导腺苷酸转化酶（adenosine deaminase，APOBEC）催化酶将目标mRNA降解，进而抑制基因的表达。
RNA干扰技术已经得到广泛应用，主要包括以下几个方面： - 基因功能研究：通过沉默特定基因，观察其对细胞生长、分化和功能的影响，从而揭示基因功能和调控机制。
- 药物筛选：利用RNA干扰技术可以高通量筛选候选药物，加速新药研发过程。
- 疾病治疗：RNA干扰技术可用于治疗基因突变引起的疾病，例如肿瘤和遗传性疾病等。
2.2 基因编辑技术基因编辑技术可以通过改变基因组DNA的序列来实现对特定基因的沉默。
CRISPR-Cas9技术是目前最常用的基因编辑技术之一。
其基本原理是利用Cas9蛋白和RNA分子形成复合物，通过与目标基因的DNA序列互补结合，引导Cas9蛋白在目标位点上产生双链切割。
随后，细胞内自身的修复机制（如非同源末端联合修复）介导修复切割部位，导致目标基因的功能缺失或沉默。
基因编辑技术在基础研究和临床应用上具有广阔的前景，如下所示： - 基因功能验证：通过编辑特定基因，验证其对生物体生理和病理过程的影响，从而鉴定相关疾病发病机制。
RNA干扰与基因沉默的研究进展
RNA干扰与基因沉默的研究进展近年来，RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）和基因沉默（gene silencing）成为了生命科学领域炙手可热的研究课题。
RNAi是一种通过RNA分子的特定序列识别、结合和降解靶向mRNA的机制，从而产生基因沉默的过程。
而基因沉默是指在生物体内通过某些机制使特定基因表达降低或消失的现象，这种现象对于人类疾病的治疗有着极其潜在的价值。
本文将从RNAi和基因沉默的基本原理及现状、RNAi技术的科研应用等方面探讨RNAi与基因沉默的研究进展。
一、RNAi和基因沉默的基本原理及现状1. RNAi的发现RNAi最早是通过植物基因沉默的机制被发现的。
1990年代末期，美国康乃尔大学的Andrew Fire和Craig Mello等人发现，通过注射dsRNA（双链RNA）到线虫体内可诱导基因沉默。
这一发现打开了RNAi的大门，dsRNA在作用于某个基因的mRNA时会引发其降解而发挥基因沉默作用。
2. 基因沉默的种类基因沉默按照发挥作用的不同过程和机制可以分为全基因组沉默和局部基因沉默。
全基因组沉默是指所有基因都无法表达，涉及到基因组的整体性问题。
而局部基因沉默则是指某些特定的基因在某些细胞或某些阶段无法表达。
3. RNAi的机制RNAi的本质是通过RNA分子将信息从基因转录到蛋白质的过程中截断。
RNAi主要分为siRNA（小干扰RNA）和miRNA（微小RNA）。
siRNA通过降解被标记为靶标的mRNA，从而防止它被翻译成蛋白质。
miRNA则是专门调节基因表达的一类RNA，大多数miRNA通过结合到靶标mRNA上来实现基因沉默。
4. 基因沉默技术的现状基因沉默技术可以通过RNAi、外源DNA导入、CRISPR/Cas9等方式实现。
其中CRISPR/Cas9技术是当前最热门的一种基因编辑技术，其原理是通过针对特定DNA序列的RNA和Cas9蛋白组成的RNA-蛋白复合物实现DNA切割和编辑。
RNA诱导基因沉默技术的发展与应用
RNA诱导基因沉默技术的发展与应用随着生物学研究的不断深入，人们对基因的理解也越来越深入。
而基因的发现和研究通常需要使用多种分子生物学技术。
在分子生物学技术中，RNA干扰（RNAi）被广泛应用于基因沉默和基因功能研究中。
以RNAi作为基础的基因沉默技术，则在近二十年以来的普及中演化出几种表现形态和多样化的注册手段。
本文将就RNA诱导基因沉默技术的发展和应用做一简单概述。
1、RNAi技术初探RNA干扰（RNAi）是由安德鲁·火（Andrew Fire）和克雷格·M·芒特路（Craig Mello）在1998年发现的。
RNAi是通过序列特异性识别靶基因mRNA并使之降解的一种细胞内转录后调控机制。
RNAi技术可以沉默特定的基因，从而研究这些基因的功能，并在疾病治疗和相关领域具有广泛的应用前景。
在RNAi过程中，双链RNA（dsRNA）被切割成22条核苷酸长的小分子RNA，即小干扰RNA（siRNA）。
siRNA可与一个酶复合物（RNA诱导的靶向酶复合物或RISC）结合。
RISC通过siRNA与mRNA互补的序列辨识和分解靶mRNA，从而表达基因的沉默。
2、RNAi的或许未来RNAi技术已经成为基因调控和药物靶点筛选的有力工具，在基因治疗和基因靶向药物方面具有潜在的应用。
RNAi技术也被广泛应用于许多动植物系统中，成为环境生物技术和生物安全领域的一个主要研究方向。
例如，RNAi可用于控制虫害和草害。
约80%的害虫基因可以编码RNAi靶标序列，这为发展具有靶向害虫基因的农药提供了新的思路。
RNAi技术有望在未来替代传统的化学农药，使农业生产可持续发展和环保。
3、RNAi技术的发展RNAi技术的发展经历了漫长的过程。
RNAi发现于1985年，但当时并没有明确的机理。
1993年，杨SC等人发现在拟南芥中使用了dsRNA，对目标基因进行了编码，引发了一定的RNAi效应。
然而，这个发现并没有引起足够的注意。
rnai的生物学意义
rnai的生物学意义
RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种生物学现象，发现于1990年代。
它是由双链RNA（特别是小干扰RNA）介导的基因沉默和基因表达调控机制。
RNAi在生物学中有以下重要意义：
1. 基因沉默：RNAi可以通过通过降解特定mRNA分子来沉默该基因的表达。
这种基因沉默可以帮助研究人员研究特定基因的功能，从而了解生物体内各种生理过程的调控机制。
2. 基因调控：RNAi可以调节基因表达，并在细胞和组织发育、免疫响应和其他生物过程中起到关键作用。
通过使用RNAi技术，可以选择性地调控特定基因的表达水平，从而研究和解析这些基因在不同生物过程中的功能。
3. 疾病治疗：RNAi技术可以用于治疗某些疾病，尤其是与基
因突变相关的遗传病。
通过设计特定的小干扰RNA，可以将
其导入患者的细胞中，以抑制或恢复异常基因的表达，从而实现疾病治疗的效果。
4. 基因组功能鉴定：通过应用RNAi技术，可以对整个基因组
进行系统性功能鉴定，从而帮助研究人员理解基因与二次代谢产物或其他生物活性物质之间的关系，为生物学研究提供了一种高效的方法。
总而言之，RNA干扰在生物学中具有关键意义，不仅帮助解
析基因调控和功能，还为疾病治疗和基因组学研究提供了强大的工具。
第四章 RNAi 与基因沉默
Sense sequence
Anti-sense Anti-sense sequence sequence
Hair-pin loop
lentiviral construct for siRNAs
Rubinson et al Nature Genetics, 2003
Vectors expressing siRNAs
二、RNAi的机理
（一）.参与RNAi反应的酶
Dicer 酶是 RNA 酶Ⅲ家族的一个成员。 RNA 酶Ⅲ是一种 能切割双链RNA的酶。 Dicer酶参与RNAi反应，广泛存 在于蠕虫，果蝇，真菌，植物及哺乳动物。 结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构 域，一个双链 RNA 结合位点。 Dicer 酶的作用下， 双链 RNA 被裂解成 21 到 23 个核苷酸的片断，称为 siRNA（short interference RNA），它启动了细胞 内的RNAi反应。 细胞内存在RNAi效应的扩增系统。能以RNA为模板指导 RNA合成的聚合酶（RNA-directed RNA polymerase， RdRP）。在RdRP的作用下，进入细胞内的双链RNA通过 类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增。
An Unexpected Result
From: Gura,2000.
Late 1980s, Rich Jorgenson and group chalone synthase for deeper purple petunias Got white and variegated Co-suppression: both endogenous and introduced genes silenced [Napoli et al., 1990] PTGS – but what is the causative factor? Similar effects seen in N. crassa “Quelling” [Cogoni et al., 1996]
《RNAi与基因沉默》PPT课件
指转录物间的碱基配对以及转录物内的碱基配对造成同源转录物的降解。
7.RdRP模型：
在线虫中，小量的dsRNA 能够使大量的靶RNA沉默，这种现象至少有 三种机制：A、Dicer酶将长dsRNA分子切成短的“初级”siRNA， 因为每 一个siRNA具有结合一个同源mRNA的能力，效应的放大水平取决于dsRNA 的长度 。B、siRNA在酶作用中，可多次应用，能提供进一步放大。 C、 短RNAs可作为靶mRNA的引物启动一个RNA诱导的RNA聚合反应，产 生次级siRNAs
5.异常RNA模型(aberrant RNA model)：
转基因DNA和RNA相互作用或内源和外源基因DNA间的相互作用导 致基因转录区域的甲基化，产生异常RNA，异常RNA触发所有相关转录物 的特异性降解
6.分子间(内)碱基配对模型(inter-or intra-molecular base pairing
C、找出起始密码子下游的AA二连序列 ，将连同其后19个bp一起作为siRNA的
1.植物体内基因沉默
植物
位置效应
（拟南介）
转基因沉默
2. 线虫 dsRNA
基因沉默
3.果蝇 RNaseIII siRNA 基因沉默
4. 鼠胚胎细胞
siRNA
基因沉默
（ dsRNA能够引起正常细胞的非程序性凋亡）
4. RNA阈值模型(RNA threshold model) ：
Lindbo 等认为RNA 干涉是细胞质中mRNA 的监控系统,当某种mRNA 超量表达时,监控系统就将这种超量表达的mRNA 降解。
1. 干扰RNA（siRNA）及合成原则：
A、一般选择的区域是以靶基因转录物的AUG起始密码子下游50－100bp
《RNAi与基因沉默》课件
在1990年代初期，科学家们发现双链RNA可以诱导基因沉默，但具体的机制和作用方式并不清楚。随着研究的 深入，人们逐渐揭示了RNAi的分子机制和生物学意义。在1998年，Andrew Fire和Craig Mello因为发现了 RNAi机制而获得了诺贝尔生理学或医学奖。
RNAi作用机制
总结词
RNAi过程中可能产生脱靶效应，影响实验 结果的准确性和可靠性。
体内应用难度
在体内应用RNAi技术时，面临如何将 siRNA有效递送到靶细胞的问题。
细胞毒性
某些RNAi分子可能对细胞产生毒性，影响 实验结果。
伦理和法规问题
在人类和动物实验中，需要考虑伦理和法规 问题，确保实验的合法性和道德性。
未来研究方向与展望
基因沉默与疾病
基因沉默与许多疾病的发生和发展密切相关。例如，肿瘤、神经退行性疾病和遗传性疾病等许多疾病都 涉及到基因沉默现象。因此，深入了解基因沉默的机制可以为这些疾病的治疗和预防提04
关系
RNAi在基因沉默中的作用
基因沉默的触发机制
RNAi通过降解目标mRNA或抑制其 翻译，在转录后水平上调节基因表达 ，从而触发基因沉默。
发展新型RNAi技术
针对现有技术的不足，发展更高效、 低毒、特异的RNAi技术。
拓展应用领域
将RNAi技术应用于更多领域，如神 经科学、免疫学等。
深入研究作用机制
深入探究RNAi的作用机制，为技术 的改进和应用提供理论支持。
加强法规监管
制定和完善相关法规和伦理规范，确 保RNAi技术的合理应用和健康发展 。
RNAi的作用机制是通过双链RNA诱导特异性mRNA的降解来实现基因沉默的。在细胞 内，dsRNA被切割成小干扰RNA（siRNA），这些siRNA与mRNA结合并诱导其降解
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基因沉默与RNAi技术定义：基因沉默双是指链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA 与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。
RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。
由双链引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质靶mRNA序列特异性的降解机制。
有时转基因会同时导致TGS和PTGS。
基因沉默是一种RNA干扰技术。
RNA干扰是由双链RNA 引发的转录后基因静默机制。
其原理是：RNaseIII核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21 - 25nt及3'端突出的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA - induced silencing complex，RISC结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制.一、基因沉默的分类及其机制（一）转录水平基因沉默转录水平基因沉默是指对基因专一的细胞核ＲＮＡ合成的失活，它的发生主要是由于基因无法被顺利转录成相应的ＲＮＡ而导致基因沉默。
转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。
引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种：１．基因及其启动子甲基化甲基化是活体细胞中最常见的一种ＤＮＡ共价修饰形式，通常发生在ＤＮＡ的ＣＧ序列的碱基上，该区碱基甲基化往往导致转录受抑制，该区甲基化的频率在人类及高等植物中分别可达４％和３６％。
［４］近来的研究表明，发生在转基因启动子５'端的甲基化是造成转录水平基因沉默的主要原因。
虽然转基因的甲基化可延伸至转基因的３'端，但甲基化过程均是从启动子区域开始的。
从所报道的转基因沉默例子来看，几乎所有的转基因沉默现象与转基因及其启动子的甲基化有关。
２．同源基因间的反式失活反式失活主要是由于拥有同源序列的沉默位点和其他位点的ＤＮＡ的相互作用而引起的基因沉默。
通过顺式作用而甲基化并失活的基因能作为一种"沉默子"，对其他与之分离的具有同源性的靶基因施加一种反式作用，使具有同源序列的靶基因发生甲基化并导致失活。
反式失活的靶基因既可以与沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。
３．后成修饰作用导致的基因沉默后成修饰作用是指转基因的序列和碱基组成不发生改变，但是其功能却在个体发育的某一阶段受到细胞因子的修饰作用后而关闭。
这种修饰作用所造成的转基因沉默是可以随着修饰作用的解除而被消除。
后成修饰作用导致的转基因沉默与受体植物的核型构成有关。
４．重复序列外源基因如果以多拷贝形式整合到同一位点上，形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重复，则不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。
这种重复序列诱导的基因沉默与在真菌中发现的重复序列诱导的点突变相类似，均可能是重复序列间自发配对，甲基化酶特异性识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑制其表达。
５．位置效应位置效应是指基因在基因组中的位置对其表达的影响。
当外源基因整合到高度甲基化、转录活性低的异染色质区域时，外源基因一般表现沉默，这说明毗邻ＤＮＡ的甲基化和异染色质化对插入的外源基因影响很大，可能导致外源基因在转录水平上失活。
如果转基因插入转录不活跃区域或异染色质区域，转基因通常会融人该区域的染色质结构，使转基因进行很低水平的转录，或使转基因发生异染色质化而导致转基因沉默。
（二）转录后水平基因沉默转录后水平基因沉默是指基因在细胞核能稳定转录，但在细胞质里却无相应稳定态ｍＲＮＡ存在的现象。
与转录水平基因沉默不同，转录后水平基因沉默具有逆转性，即受抑制基因通过减数分裂可以恢复表达活性，表现为减数分裂不可遗传性。
目前发现主要有以下几种转录后水平基因沉默现象。
１．共抑制共抑制是最常见的转录后水平基因沉默。
这一现象首先由Ｎａｐｏｌｉ在转ＣＨＳ基因的矮牵牛花中发现。
共抑制现象普遍存在于转基因植物中。
共抑制的发生是由于外源基因编码区与受体细胞基因间存在同源性而导致外源基因与源基因的表达同时受到抑制。
具有同源性的外基因和源基因在细胞核的转录速率很高，但在细胞质无ｍＲＮＡ积累，是典型的转录后水平基因沉默。
若导入的外源基因与源基因无序列同源性，外源基因自身也常常会发生转录后水平基因沉默。
有关研究发现，共抑制的产生不仅同、外源基因间编码区的同源性有关，还与控制外源基因的启动子的强度等因素有关。
２．基因压制Ｃｏｇｏｎｉ等在粗糙脉抱霉的转化实验中发现，外源基因可以抑制自身和相应源基因的表达，他们把这一现象定为基因压制。
Ｃｏｇｏｎｉ等是以类萝卜素生物合成基因ａｌｂｉｎｏ－１作为视觉报道基因来研究基因压制的。
他们发现，基因压制是可逆的，而且这种逆转会伴随有外源拷贝的丢失。
基因压制发生在转录后水平，导致已复制的稳定态ｍＲＮＡ大量减少。
３．ＲＮＡ干扰ＲＮＡ干扰是１９９８年Ｆｉｒｅ首次在秀丽线虫中发现并证明属于转录后水平的基因沉默。
利用小片段双链ＲＮＡ可以特异性地降解相应序列的ｍＲＮＡ，从而特异性地阻断相应基因的表达。
ＲＮＡ干扰广泛存在于从真菌到植物、从无脊椎动物到哺乳动物的各种生物中。
ＲＮＡｉ的作用机制目前尚不完全清楚，学者们在线虫、果蝇、植物和动物卵细胞的ＲＮＡｉ实验中，最近相继发现了一些与ＲＮＡｉ作用相关的酶和蛋白，如ｄｓＲ－ＮＡ特异性核酸切酶、ＲＮＡ依赖性ＲＮＡ聚合酶、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白等。
现已初步阐明ＲＮＡｉ的作用机制如下：各种ｄｓＲＮＡ通过各种转染技术转入细胞，较长ｄｓＲＮＡ被Ｄｉｃｅｒ的ＲＮＡ酶Ⅲ样特异性核酸切酶切割产生２１～２３ｎｔ的小干扰ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ两条单链末端为５＇－磷酸和３′－羟基，且３′端都有２～３个突出的核苷酸。
核酸外切酶、ＡＴＰ、解旋酶与Ａｒｇ－ｏｎａｕｔｅ蛋白相连进而与ｓｉＲＮＡ一起形成具有多个亚单元的ＲＮＡ诱导的沉默复合体ＲＩＳＣ中的解旋酶应用ＡＴＰ解开ｓｉＲＮＡ双链，使其反义链互补结合到靶向的ｍＲＮＡ上与之相匹配的特异性序列，ＲＩＳＣ中的核酸酶降解ｍＲＮＡ，从而使目的基因沉默，产生ＲＮＡｉ现象。
ｓｉＲＮＡ也能与ＲＩＳＣ和ｍＲＮＡ联系在一起，在解开ｓｉＲＮＡ的双链后，反义ＲＮＡ链能作为双链ＲＮＡ合成的一个引物以ｍＲＮＡ为模板，在ＲＩＳＣ中的ＲｄＲＰ的作用下形成新的ｄｓＲＮＡ，再次被Ｄｉｃｅｒ识别并切断，形成新的ｓｉＲＮＡ再循环，作用于另外的靶向ｍＲＮＡ。
这种不断放大的瀑布式作用形成大量新的ｓｉＲＮＡ，使ｓｉＲＮＡ在短时间迅速并有效地抑制ｍＲＮＡ翻译形成蛋白质或多肽，从而有效地抑制靶向基因蛋白质或多肽的合成。
ｏｎａｕｔｅ蛋白相连进而与ｓｉＲＮＡ一起形成具有多个亚单元的ＲＮＡ诱导的沉默复合体ＲＩＳＣ中的解旋酶应用ＡＴＰ解开ｓｉＲＮＡ双链，使其反义链互补结合到靶向的ｍＲＮＡ上与之相匹配的特异性序列，ＲＩＳＣ中的核酸酶降解ｍＲＮＡ，从而使目的基因沉默，产生ＲＮＡｉ现象。
ｓｉＲＮＡ也能与ＲＩＳＣ和ｍＲＮＡ联系在一起，在解开ｓｉＲＮＡ的双链后，反义ＲＮＡ链能作为双链ＲＮＡ合成的一个引物以ｍＲＮＡ为模板，在ＲＩＳＣ中的ＲｄＲＰ的作用下形成新的ｄｓＲＮＡ，再次被Ｄｉｃｅｒ识别并切断，形成新的ｓｉＲＮＡ再循环，作用于另外的靶向ｍＲＮＡ。
这种不断放大的瀑布式作用形成大量新的ｓｉＲＮＡ，使ｓｉＲＮＡ在短时间迅速并有效地抑制ｍＲＮＡ翻译形成蛋白质或多肽，从而有效地抑制靶向基因蛋白质或多肽的合成。
二、基因沉默的相关实验技术及其进展目前在基因沉默中主要是ＲＮＡ干扰的实验技术应用较多，根据靶ｄｓＲＮＡ合成的方法可将ＲＮＡｉ技术分为３种。
１．体外化学合成法最为经典的方法，共分４个步骤：（１）化学合成ｄｓＲＮＡ；（２）将ｄｓＲＮＡ导入宿主细胞；（３）检测靶基因抑制效率；（４）功能研究。
其中，ｄｓＲＮＡ合成成本很高，ｄｓＲＮＡ转入宿主细胞效率及其在宿主细胞中的稳定性均不确定。
２．体外转录法这种方法采用Ｔ７ＲＮＡ聚合酶，以先合成的ＤＮＡ链为模板反转录合成ｄｓＲＮＡ，从而使合成ｄｂＲＮＡ的成本大大降低，但这种方法与化学合成法有相同的缺点。
３．体载体合成法这是近年来迅速发展起来，克服了前两种方法缺点的新技术。
它是２００２年Ｐａｄｄｉｓｏｎ等首先报道的利用载体在细胞体稳定地表达ｓｉＲＮＡ，从而抑制哺乳动物细胞靶基因表达的方法。
其基本思路如下：细胞存在ＲＮＡｐｌｙｍｅｒａｓｅⅢ，它可以识别Ｕ６启动子，从而使启动子后的基因转录成ＲＮＡ。
当模板连续出现３～５个"Ｔ"碱基时，转录就会终止。
根据这一机制，可以设计一种能表达ＲＮＡ的质粒，其组成包括４部分：（１）常用质粒的基本序列；（２）Ｕ６启动子，位于克隆位点的上游；（３）克隆位点；（４）ＲＮＡｉ模板序列（ＤＮＡ）。
这部分序列具有如下特点：含ＲＮＡｉ序列，对哺乳动物而言，通常为２１～２３个核苷酸；发夹结构环状部分，通常有４～７个核苷酸；靶序列的反向互补序列；３～５个核苷酸"Ｔ"。
将具有如上结构的质粒导入细胞，体的ＲＮＡｐｌｙｍｅｒａｓｅⅢ就可以合成一条ＲＮＡ链，这条ＲＮＡ链可以通过两端的２１个左右的核苷酸反向互补特性而形成发夹样双链结构，从而起到基因抑制作用。
这种技术操作简便，成本低，与直接导入ｓｉＲＮＡ相比，ＤＮＡ质粒更易导入细胞，而且质粒导入细胞后存在时间长且稳定，对靶基因的表达抑制效率高，便于进行较长时间的基因功能研究，因而成为一种热门技术。
近年来多位作者几乎同时报道了利用上述载体技术成功地抑制哺乳动物细胞基因表达的实验。
除质粒载体外，现已有成功地采用逆转录病毒载体和腺病毒载体将表达ｓｉＲＮＡ的ＤＮＡ模板序列转移入哺乳动物细胞的报道。
三、基因沉默的应用前景抗肿瘤ＲＮＡｉ具有特异、高效的特点，因此可用于一些肿瘤的治疗。
最近Ｌｉｎ等把针对ｂｃｌ２基因的ｍＲＮＡｃＤＮＡ杂交体转染到人前列腺癌细胞中，产生长时期阻抑表达效应，此效应与体外培养的前列腺癌细胞中的ＲＮＡｉ相似，进而说明哺乳动物中可以发生ＲＮＡｉ。
Ｍｉｌｎｅｒ教授应用ＲＮＡｉ技术特异性地成功沉默了感染ＨＰＶ的宫颈癌细胞中的ＨＰＶ基因，宫颈细胞的Ｖ５３和ＲＢ蛋白恢复正常功能，从而恢复了宫颈细胞正常的防御功能，使已感染ＨＰＶ的宫颈癌细胞遭遇自杀，而对其他健康细胞的正常生长和生物学行为无影响。
可以预见此技术也可应用于与ＨＢＶ感染相关的肝细胞性肝癌的基因治疗。