基因表达沉默技术
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oligodeoxyribonucleotide. Proc Natl Acad Sci USA , 1978 ;75 : 285 - 288.
31
基本概念
• 反义寡核苷酸概念：正义链互补的一段核苷酸序 列，包括反义DNA和反义RNA。
反义DNA 技术
反义RNA 技术
32
反义抑制的主要机理
直接作用于靶 mRNA的SD序列或部分编码区，直 接抑制翻译，或与靶 mRNA结合形成双链 RNA， 从而易被RNA酶H降解。 mRNA 反义 核酸
2１个硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸组成 ５＇－ＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧ－３＇
35
技术难点
提高有效性
a.避免内源性核酸酶对其降解 b.提高自身稳定性以及与靶分子的亲和力
H
deoxyribose
36
第一代硫代修饰（Phosphorothioate）
O
Resisting To Nucleases；Activating RNase H pathways
基因表达沉默技术
药学系药物基因组学教研室
2010.06.18
1
教学内容及要求
1 2
RNA干扰 技术 反义核酸技术 核酶技术 基因敲除技术
重点
3
4
熟悉
2
参考资料
《基因工程及其分子生物学基础-基因 工程分册》，北京大学出版社，静国 忠编 自备材料（个人实践经验）
3
第一节 RNA干扰技术
4
基本概念
小结
1、RNAi技术： 基本概念； RNAi技术发展历史； RNAi机制； RNAi设计。 2、反义核酸技术： 基本概念； 技术应用。 3、核酶技术： 核酶概念； 核酶发展历史； 核酶技术应用。 4、基因敲除技术： 基因敲除技术的概念； 基因敲除技术的发展历史； 基因敲除技术的建立及技术流程。
59
感想 1.意外=Key 2.科研选题：follow or create? 3.Pure scientist
60
作业
1. 简述RNAi实验设计流程
2. 简述马里奥· 卡佩基安德(Mario R．Capechiand)的“正负筛选”的策略
61
62
（1994年左右比较流行的研究工具）
48
锤头状核酶结构示意图 通常由60个核苷酸左右组成； 底物部分：含有GU序列； 保守序列：13个碱基。
49
50
第四节 基因敲除技术
时间：80年代末
功能：建立基因失活或缺失的动物模型
51
发展历史
a. 胚胎干细胞（ embryonic stem cell，ES）分离培养
siRNA 在 ATP 参 与 下 形 成RISC复合体，被RNA 解旋酶解旋成单链，并 由其中的反义链指导移 至 靶 mRNA ， 靶 mRNA 被切割后诱发宿主细胞 针 对 这 些 mRNA 的 降 解 反应。 10
重点
靶
siRNA siRNA实验设计
19 bp duplex
难点
21 nt
2 nt 3 overhangs
1978年，Stephenson 和Zamecnik首次报道了
反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒RSV的 复制现象。 1984 年，Izant weintraub提出了“反义核 酸技术”的概念。 Inhibition of Rous sarcoma viralRNA translation by a specific
C. 载体选择：易转染的细胞用质粒载体，难转染的细胞 用逆转录载体或慢病毒载体。
25
6）体外导入细胞
a.脂质体转染：
＋＋ ＋ ＋ ＋
－ － － － － ＋ －
具体操作步骤： 按照脂质体说明书进行
26
b.电穿孔导入：
27
c.病毒感染（以腺病毒为例）：
28
29
第二节 反义核酸技术
30
历史由来
5
发现历史
1995年． ． ． ． ． ．
antisense sense
注射
注射
秀丽线虫
6
． ． ． ． ． ． 1998年
反义RNA(antisense RNA)对基因抑制效应比较微弱；
而双链RNA（dsRNA）能够高效特异性阻断靶基因的
表达。
7
2006 Nobel Prize in Physiology or Medicine
掌握
RNA 干 扰 (RNA interference, RNAi): 由 小双链 RNA 诱发的、同源 mRNA 高效特异性降 解的现象。
小 干 扰 RNA: 具 有 干 扰 功 能 的 这 种短双 链 RNA 就称为小干扰 RNA （ Small interfering RNA,siRNA)。
40
Tysabri
2004 专治多发性硬化症
Leabharlann Baidu
41
42
第三节 核酶技术
43
基本概念
核酶（ribozyme） ribonucleic acid enzyme 具有催化活性的 RNA ，化学本质是 RNA, 却 具有酶的催化功能。
44
历史由来
1982
切赫(T.R.Cech)（1947-），美国人, 他独立地发现发现四膜虫转录 产物rRNA前体，可切除自身的 413个核苷酸的内含子，使两个 外显子拼接起来，变成成熟的 rRNA分子。
取自小鼠受精卵发育第4，5天的胚胎细胞
能在体外培养，保留发育的全能性 1981 年 ， 马 丁 · 埃 文 斯 (Martin J ． Evans) 从正常的小鼠囊胚中 分离到了ES细胞。小鼠ES细胞的 分离和应用是ES细胞技术发展的 里程碑。
52
b. 同源重组技术应用
同源重组：是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中 相同或者相似DNA序列间的重组，通常通过一对同源分 子非姊妹染色体间的断裂而产生新的重组片段。
11
’
1）靶序列的调出
National Center for Biotechnology Information
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
12
13
14
2）利用免费设计软件进行siRNA设计
Invitrogen
Takara Oligoegine
15
软件的选择原则
1 、选择可读框内、翻译起始位点之后 50 ～100nt 的序列作为靶序列； 2、选择的靶位5’端之前的两个碱基为AA；
RNase H
33
反义核酸应用
论著超过１６０００篇。
•基因功能研究（ 1994年流行）
•如抗病毒或抗肿瘤基因治疗研究等领域。
34
1998年8月27日，美国食品药品管理局（FDA）正 式批准了由ISIS公司开发的全球第一个反义药物 “Vitravene” （福米韦生，fomivirsen）在美国 上市。 该药抗病毒作用较强，是更昔洛韦的1000倍，用 于治疗巨细胞病毒性视网膜炎和艾滋病人并发巨 细胞视网膜炎,有效率高达80%-90%。 Vitravene为注射剂，患者每月只需注射一次药物 （利用专用针头直接注射进眼球内），不良反应 有虹膜炎、玻璃体炎，发生率为25％，用糖皮质 激素治疗可缓解或消除其炎性反应。
Andrew Z. Fire 安德鲁· 菲尔
Craig C. Mello 克雷格· 梅洛
8
RNAi现象的普遍性
随后陆续发现 RNAi 也存在于水稻、烟草、果 蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。
9
RNAi 机制
外 源 长 dsRNA 在 ATP 作 用下被RNaseⅢ Dicer切 割成 21nt 左右 、 由 正义 和反义链组成的siRNA
53
1985年，奥利弗· 史密塞斯(Oliver Smithies) 等首次报道在肿瘤细胞 中实现了人工打靶载体和内源 β球蛋白基因间的同源重组。
54
1988 年，卡佩基安德等发展了一
种称为“正负筛选”的策略，将
胸腺嘧啶激酶基因（ tk ）置于打 靶载体的外侧，作为筛选的负性
标记。这比单用阳性筛选正确克
Protein: Western blot
17siRNA
Mock
24
5)合成or构建载体？
A. 化学合成siRNA： 瞬时转染 实验花费高 使用的时候，要用二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理过的灭 菌蒸馏水溶解，这是因为siRNA易被RNA酶降解。
B.载体：为了长期观察基因沉默后的影响，需要长期表达 siRNA。
3、GC含量控制在35%～65%,最好50%左右；
4、碱基数目控制在19～21nt；
5、避免连续3个或3个以上的相同碱基； 7、靶序列同数据库进行BLAST同源性比对。
16
6、避免重复序列或回文结构以免形成发夹状结构；
我用的软件：siDirect
17
3）siRNA合成或表达
RNA聚合酶Ⅲ启动子（包括U6或H1）：
转录起始点明确； 转录生成小RNA； 转录产物无polyA尾； 转录终止为5个连续的U。
18
19
20
21
3 mg/ml 正向引物 1 μl 3 mg/ml 反向引物 1 μl 90°C 4 min 70°C 10 min 室温
22
4) siRNA working?
23
mRNA:Real-time PCR
Thomas R.Cech
45
S.Altman研究发现发现大肠杆菌RNaseP 的蛋白质部分除去后，留下RNA能 够切割rRNA前体的5’端。
1983
46
1989 Nobel Prize in Chemistry
核酶的发现改变了“所有酶都是蛋白质”的传统观念
47
应用——阻断基因的表达
有封闭 切割RNA
37
第二代修饰(2’-O-methyl,2’-O-methoxyethyl)
Resisting To Nucleases；not activating RNase H pathways 38
Macugen 哌加他尼
2001 主要用于治疗老年人中十分常见的视网膜黄斑退化症
39
Fuzeon
2003 新一代抗HIV新药，属于病毒的融合阻止剂类药物
隆富集的倍数高 3~10 倍，真正使 得同源重组技术得以应用。
丙氧鸟苷
马里奥· 卡佩基安德(Mario R．Capechiand)
55
Oliver Smithies 奥利弗· 史密斯
Martin Evans 马丁· 埃文斯
Mario Capecchi 马里奥· 卡佩基
56
原理和操作流程
57
58
31
基本概念
• 反义寡核苷酸概念：正义链互补的一段核苷酸序 列，包括反义DNA和反义RNA。
反义DNA 技术
反义RNA 技术
32
反义抑制的主要机理
直接作用于靶 mRNA的SD序列或部分编码区，直 接抑制翻译，或与靶 mRNA结合形成双链 RNA， 从而易被RNA酶H降解。 mRNA 反义 核酸
2１个硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸组成 ５＇－ＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧ－３＇
35
技术难点
提高有效性
a.避免内源性核酸酶对其降解 b.提高自身稳定性以及与靶分子的亲和力
H
deoxyribose
36
第一代硫代修饰（Phosphorothioate）
O
Resisting To Nucleases；Activating RNase H pathways
基因表达沉默技术
药学系药物基因组学教研室
2010.06.18
1
教学内容及要求
1 2
RNA干扰 技术 反义核酸技术 核酶技术 基因敲除技术
重点
3
4
熟悉
2
参考资料
《基因工程及其分子生物学基础-基因 工程分册》，北京大学出版社，静国 忠编 自备材料（个人实践经验）
3
第一节 RNA干扰技术
4
基本概念
小结
1、RNAi技术： 基本概念； RNAi技术发展历史； RNAi机制； RNAi设计。 2、反义核酸技术： 基本概念； 技术应用。 3、核酶技术： 核酶概念； 核酶发展历史； 核酶技术应用。 4、基因敲除技术： 基因敲除技术的概念； 基因敲除技术的发展历史； 基因敲除技术的建立及技术流程。
59
感想 1.意外=Key 2.科研选题：follow or create? 3.Pure scientist
60
作业
1. 简述RNAi实验设计流程
2. 简述马里奥· 卡佩基安德(Mario R．Capechiand)的“正负筛选”的策略
61
62
（1994年左右比较流行的研究工具）
48
锤头状核酶结构示意图 通常由60个核苷酸左右组成； 底物部分：含有GU序列； 保守序列：13个碱基。
49
50
第四节 基因敲除技术
时间：80年代末
功能：建立基因失活或缺失的动物模型
51
发展历史
a. 胚胎干细胞（ embryonic stem cell，ES）分离培养
siRNA 在 ATP 参 与 下 形 成RISC复合体，被RNA 解旋酶解旋成单链，并 由其中的反义链指导移 至 靶 mRNA ， 靶 mRNA 被切割后诱发宿主细胞 针 对 这 些 mRNA 的 降 解 反应。 10
重点
靶
siRNA siRNA实验设计
19 bp duplex
难点
21 nt
2 nt 3 overhangs
1978年，Stephenson 和Zamecnik首次报道了
反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒RSV的 复制现象。 1984 年，Izant weintraub提出了“反义核 酸技术”的概念。 Inhibition of Rous sarcoma viralRNA translation by a specific
C. 载体选择：易转染的细胞用质粒载体，难转染的细胞 用逆转录载体或慢病毒载体。
25
6）体外导入细胞
a.脂质体转染：
＋＋ ＋ ＋ ＋
－ － － － － ＋ －
具体操作步骤： 按照脂质体说明书进行
26
b.电穿孔导入：
27
c.病毒感染（以腺病毒为例）：
28
29
第二节 反义核酸技术
30
历史由来
5
发现历史
1995年． ． ． ． ． ．
antisense sense
注射
注射
秀丽线虫
6
． ． ． ． ． ． 1998年
反义RNA(antisense RNA)对基因抑制效应比较微弱；
而双链RNA（dsRNA）能够高效特异性阻断靶基因的
表达。
7
2006 Nobel Prize in Physiology or Medicine
掌握
RNA 干 扰 (RNA interference, RNAi): 由 小双链 RNA 诱发的、同源 mRNA 高效特异性降 解的现象。
小 干 扰 RNA: 具 有 干 扰 功 能 的 这 种短双 链 RNA 就称为小干扰 RNA （ Small interfering RNA,siRNA)。
40
Tysabri
2004 专治多发性硬化症
Leabharlann Baidu
41
42
第三节 核酶技术
43
基本概念
核酶（ribozyme） ribonucleic acid enzyme 具有催化活性的 RNA ，化学本质是 RNA, 却 具有酶的催化功能。
44
历史由来
1982
切赫(T.R.Cech)（1947-），美国人, 他独立地发现发现四膜虫转录 产物rRNA前体，可切除自身的 413个核苷酸的内含子，使两个 外显子拼接起来，变成成熟的 rRNA分子。
取自小鼠受精卵发育第4，5天的胚胎细胞
能在体外培养，保留发育的全能性 1981 年 ， 马 丁 · 埃 文 斯 (Martin J ． Evans) 从正常的小鼠囊胚中 分离到了ES细胞。小鼠ES细胞的 分离和应用是ES细胞技术发展的 里程碑。
52
b. 同源重组技术应用
同源重组：是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中 相同或者相似DNA序列间的重组，通常通过一对同源分 子非姊妹染色体间的断裂而产生新的重组片段。
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’
1）靶序列的调出
National Center for Biotechnology Information
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
12
13
14
2）利用免费设计软件进行siRNA设计
Invitrogen
Takara Oligoegine
15
软件的选择原则
1 、选择可读框内、翻译起始位点之后 50 ～100nt 的序列作为靶序列； 2、选择的靶位5’端之前的两个碱基为AA；
RNase H
33
反义核酸应用
论著超过１６０００篇。
•基因功能研究（ 1994年流行）
•如抗病毒或抗肿瘤基因治疗研究等领域。
34
1998年8月27日，美国食品药品管理局（FDA）正 式批准了由ISIS公司开发的全球第一个反义药物 “Vitravene” （福米韦生，fomivirsen）在美国 上市。 该药抗病毒作用较强，是更昔洛韦的1000倍，用 于治疗巨细胞病毒性视网膜炎和艾滋病人并发巨 细胞视网膜炎,有效率高达80%-90%。 Vitravene为注射剂，患者每月只需注射一次药物 （利用专用针头直接注射进眼球内），不良反应 有虹膜炎、玻璃体炎，发生率为25％，用糖皮质 激素治疗可缓解或消除其炎性反应。
Andrew Z. Fire 安德鲁· 菲尔
Craig C. Mello 克雷格· 梅洛
8
RNAi现象的普遍性
随后陆续发现 RNAi 也存在于水稻、烟草、果 蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。
9
RNAi 机制
外 源 长 dsRNA 在 ATP 作 用下被RNaseⅢ Dicer切 割成 21nt 左右 、 由 正义 和反义链组成的siRNA
53
1985年，奥利弗· 史密塞斯(Oliver Smithies) 等首次报道在肿瘤细胞 中实现了人工打靶载体和内源 β球蛋白基因间的同源重组。
54
1988 年，卡佩基安德等发展了一
种称为“正负筛选”的策略，将
胸腺嘧啶激酶基因（ tk ）置于打 靶载体的外侧，作为筛选的负性
标记。这比单用阳性筛选正确克
Protein: Western blot
17siRNA
Mock
24
5)合成or构建载体？
A. 化学合成siRNA： 瞬时转染 实验花费高 使用的时候，要用二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理过的灭 菌蒸馏水溶解，这是因为siRNA易被RNA酶降解。
B.载体：为了长期观察基因沉默后的影响，需要长期表达 siRNA。
3、GC含量控制在35%～65%,最好50%左右；
4、碱基数目控制在19～21nt；
5、避免连续3个或3个以上的相同碱基； 7、靶序列同数据库进行BLAST同源性比对。
16
6、避免重复序列或回文结构以免形成发夹状结构；
我用的软件：siDirect
17
3）siRNA合成或表达
RNA聚合酶Ⅲ启动子（包括U6或H1）：
转录起始点明确； 转录生成小RNA； 转录产物无polyA尾； 转录终止为5个连续的U。
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21
3 mg/ml 正向引物 1 μl 3 mg/ml 反向引物 1 μl 90°C 4 min 70°C 10 min 室温
22
4) siRNA working?
23
mRNA:Real-time PCR
Thomas R.Cech
45
S.Altman研究发现发现大肠杆菌RNaseP 的蛋白质部分除去后，留下RNA能 够切割rRNA前体的5’端。
1983
46
1989 Nobel Prize in Chemistry
核酶的发现改变了“所有酶都是蛋白质”的传统观念
47
应用——阻断基因的表达
有封闭 切割RNA
37
第二代修饰(2’-O-methyl,2’-O-methoxyethyl)
Resisting To Nucleases；not activating RNase H pathways 38
Macugen 哌加他尼
2001 主要用于治疗老年人中十分常见的视网膜黄斑退化症
39
Fuzeon
2003 新一代抗HIV新药，属于病毒的融合阻止剂类药物
隆富集的倍数高 3~10 倍，真正使 得同源重组技术得以应用。
丙氧鸟苷
马里奥· 卡佩基安德(Mario R．Capechiand)
55
Oliver Smithies 奥利弗· 史密斯
Martin Evans 马丁· 埃文斯
Mario Capecchi 马里奥· 卡佩基
56
原理和操作流程
57
58