细胞工程》第4章3：动物细胞培养工程

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生物合成相关代谢调节和调节网络理论 • 代谢工程 代谢流及节点分析
理论涉及 碳源、呼吸系统和氧化还原重新设计 主要内容 中心代谢产物作用机制及相关代谢分析
B、代谢流及中间产物分析——静态分析 C、代谢控制分析——动态分析
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4．6．3 代谢调节的基本类型及其机制
A、代谢调节的基本类型 直线式代谢的反馈控制 协作式多价反馈控制 合作反馈控制
A、初级分离——离心、过滤、吸附 B、纯化——色谱法 C、制剂与冷冻干燥
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4．7．2 动物细胞工程产品的质量控制 PAGE
纯度 SDS-PAGE 液相色谱
A、物化指标测定 含量
B、安全性评介 分子量
C、稳定性
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4．8 动物细胞工程表达产品的应用
4．8．1 重组蛋白药物
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D、代谢工程 （也称途径工程，pathway engineering）
——是指应用重组DNA技术和分析生物学相关的 遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶 的功能和输送体系的功能，甚至改变产能系统的 功能，以改变细胞某些方面代谢活性的整套工作 （包括代谢分析、代谢设计、遗传操作和目的代 谢活性的实现）；即是指生物化学反应代谢网络 有目的地被修饰。
重组IFN-β 点突变改造，使Cys17变为中性氨基酸， 如：丝、酪氨酸，商品名为：IFN-β-1b CHO细胞表达，与天然一样，天然糖基化， 分离简单。
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C、新型红细胞生成刺激蛋白（NESP）
B、主要内容： 生产工艺的放大、生产工艺的稳定性和重复性。
C、初步研究： 首先必须较快建立一个基本（不要求是最优）的细
胞培养工艺。
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4．5．2 动物细胞培养工艺的优化
A、影响蛋白质产量的关键参数， 营养物耗尽；
B、决定细胞浓度 有毒废物的积累 的关键参数 培养物理条件的恶化
提高蛋白质表达水平
细 胞 工 Cell Engineering 程
Chapter 4、动物细胞培养工程
4．1 概述 4．2 生产用动物细胞系 4．3 培养液和培养环境 4．4 动物细胞培养工艺 4．5 动物细胞培养过程的放大与优化 4．6 动物细胞代谢工程 4．7 动物细胞工程产品制备及质控 4．8 动物细胞工程表达产品的应用
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B、β-干扰素（IFN-β）
最早，为一种在同种细胞上具有广谱抗病 毒活性的蛋白质，普遍存在于个体脾、肝、 肾、淋巴细胞、骨髓，被多因素诱发，现为 一组多功能细胞因子，具有抗病毒、肿瘤活 性，调节免疫反应，控制细胞生长与分化，
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天然IFN-β——刺激体外培养人成纤维细胞， 大肠杆菌表达，活性低，不稳定， Cys17形成二硫键，缺少N-Met，无糖基化
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A、组织型纤溶酶原活化剂（t-PA）突变体 Tenecteplase，商品名TNKaseTM，
急性心肌梗死病人溶栓治疗， 人t-PA基因位于8号染色体p12-q11.2， 全长36594bp，14个外显子，13个内含子， t-PA由527个氨基酸，单链糖蛋白，开始 酵母表达，不能分离纯化 t-PA突变体，由双链糖蛋白， 现用CHO细胞高效表达成功（参见下图）
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4．5 动物细胞培养过程的 放大与优化
4．5．1 动物细胞培养工艺的研究
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A、开发重要性： 真核细胞表达产物糖基化，有疗效；
动物细胞体外培养广泛应用于基因工程蛋白质与病
毒疫苗等生产；动物细胞表达产品十分昂贵，开发周期
长，研发成本高，技术难度大；如：美国，Immunex公 司，已被Amgen公司兼并，生产治疗风湿性关节炎蛋白 药物，2.6g/人、年×6154美元/g=16000美元，2002年， 销售额达8.02亿美元，其中，被替代损失10亿，因为产 量低，计划投入数亿美元，耗时3-5年，扩大规模、优 化生产工艺，提高产量。
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4．6．2 基本原理
A、代谢网络理论 • 细胞代谢网络由上万种酶催化的系列反应系 统、膜传递系统、信号传递系统组成，并且既受 精密调节，又互相协调； • 代谢网络分泌处的代谢产物称为节点。根据 可变程度节点可分：柔性节点、刚性节点和半柔 性节点； • 柔性和半柔性节点是代谢工程设计的主要对 象，节点刚性程度在改选前要进行分析判断；
A、生命的代谢活动是通过活细胞和细胞 群的代谢网络进行的，后者由一系列酶催化 的级联化学反应以及特异性的膜转移系统所 构成。然后，活细胞这种自身固有的代谢网 络相对实际应用而言，其遗传特性并非最佳 ，需要对细胞代谢途径进行修饰；
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B、代谢控制发酵 （metabolic control fermentetion） ——是指利用遗传学或生物化学方法，人 为地在DNA分子水平上改变和控制微生物 的代谢，使目的产物大量的生成、积累的 发酵； C、在代谢控制发酵的理论基础上，提出 和形成了“代谢工程”概念；
C、细胞培养工艺 细胞新陈代谢的控制
优化策略
流加工艺的优化
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4．5．3 动物细胞培养工艺的放大
A、生物反应器尺寸放大 鼓泡
B、氧气的传输 提高氧气传递的其它方法
搅拌速率和搅拌器的设计 C、混合
剪切力和细胞损伤 D、工业生产中的动物细胞培养
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Fra Baidu bibliotek
4．6 动物细胞代谢工程
4．6．1 概述
代谢通量分析（MFA）— 静态
B、研究
代谢控制分析（MCA）— 动态
方法 代谢网络 生化系统理论（BST）— 最优化原理
定量分析 控制论模型（CM）— 非线性
途径分析——途径定位
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C、代谢模型的 发展与优化
细胞代谢模型 计算生物学方法
神经网络 遗传算法
D、逆代谢工程
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4．7 动物细胞工程产品制备及质控 4．7．1 动物细胞工程产品制备
累积反馈控制 顺序反馈控制 同工酶控制
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B、酶合成及酶活性的调节机制
酶的阻遏 和酶的诱导
末端代谢产物阻遏 酶合成的分解代谢物阻遏 酶的诱导与合成 变构 酶活性的调节 同工
多功能酶
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4．6．4 代谢工程的研究方法
A、设计思路改变代谢流
扩展代谢途径和构建新的代谢途径
常规方法——分子生物、生化、物化