石蜡切片的制作

石蜡切片的制作
试验药品和仪器
试验药品：酒精、二甲苯、石蜡、番红、固绿、冰醋酸、甲醛、明胶、甘油、石碳酸、中性树胶。

试验仪器：石蜡切片机、组织包埋机、水浴锅、染缸、烘箱。

试验方法
1 叶片组织结构的观察
对叶片组织结构的观察采用石蜡切片法。

具体操作步骤如下：
1. 取材。

选取生长良好的叶片，用水清洗干净，擦干，沿主脉切取2m m×5mm 的小段。

2. 固定。

将切取的植物材料立即放入FAA固定液中（材料与固定液比例1:20），用真空泵抽气（使固定液尽快渗入材料中，并排除材料内气泡的干扰），固定时间48h以上。

FAA固定液配方：50%酒精、冰乙酸、甲醛（37%-40%）按18:1:1的比例配置。

3. 冲洗。

材料从固定液中取出后，用70%的酒精冲洗3次，每次间隔2h，并在70%酒精中过夜。

4. 脱水。

酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行：70%酒精—80%酒精—95%酒精—无水酒精—无水酒精，每级酒精中放2h，无水酒精分2次，一次2h。

5. 透明。

纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。

材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。

通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。

具体为：1/3二甲苯+2/3无水酒精（加番红染色，以便透明后找到材料）—1/2二甲苯+1/2无水酒精—2/3二甲苯+1/3无水酒
精—二甲苯—二甲苯，每级二甲苯中放2h，纯二甲苯分2次，每次放1h。

材料进入无水的透明剂中后，若透明剂变浑浊，说明材料中的水分未脱干净，必须回到前面一级无水的脱水剂中再次脱水。

6. 浸蜡。

夏季采用熔点较高的石蜡（56-58）,冬季宜选用熔点较低的石蜡（52-54）。

新蜡应溶一次，增加密度，反复溶的旧蜡包埋效果更好。

在溶蜡箱中进行55-60℃，恒温。

二甲苯透明后的组织块在二甲苯：石蜡（1：1）中1次，在石蜡中2次，每次3h左右。

7. 包埋。

在室温进行，在包埋盒上做好标记。

8. 修块。

将包埋好的石蜡块修成梯形或长方形块状，粘于小木块上。

9. 切片粘片与。

通常切片厚度为8～12微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。

在载玻片上先滴一滴甲液，用小拇指涂匀，然后再滴数滴乙液，用镊子把选好的蜡带放到载玻片上，用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后操作中使材料脱落。

常用的粘片剂－郝伯特(Haupt) 粘贴剂：甲液：动物胶1克+馏水100毫升+甘油15毫升+石碳酸2克，乙液：甲醛4毫升+蒸馏水100毫升。

10. 展片。

将载玻片放入36℃的水浴锅中（水上铺塑料薄膜，薄膜上放载玻片，以防蜡带过轻在水中漂浮）进行展片。

11. 干片。

待蜡带展好后，把载玻片放进恒温箱（36℃）进行干片，以免蜡带从载玻片上脱离，一般24h。

12. 染色。

其顺序如下：二甲苯→2/3 二甲苯+1/3纯酒精→1/2 二甲苯+1/2纯酒精→1/3 二甲苯+2/3纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→番红染液→70％酒精→85％酒精→固绿染液→95％酒精→100%酒精→100%酒精→1/3 二甲苯+2/3纯酒精→1/2 二甲苯+1/2纯酒精2/3 二甲苯+1/3纯酒精→二甲苯→二甲苯。

载玻片在每步中停放4min,在番红染液中放8h-12h。

番红染液：0.1g番红溶入70％酒精定溶至100ml。

固绿染液：0.1g固绿溶入95％酒精定溶至100ml。

13. 封片。

二甲苯透明后，将载玻片从二甲苯中取出，务必使有材料的一面
朝上，迅速在材料上加适量（1～2滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡。

加拿大树胶溶于二甲苯中成为——二甲苯-加拿大树胶液。

绝对不能混入水和酒精，否则树胶回浑浊，不能观察。

14. 干片。

将封片后的载玻片放入恒温箱（36℃）中进行干片，贴上标签，制成永久切片，避光保存。

15. 观察。

在Olympus 光学显微镜下观察并测量其叶片厚度、栅栏组织及海绵组织厚度，每一样片观察10 个视野。

2 叶片气孔结构的观察
对叶片气孔结构的观察，采用透明胶带粘取法。

具体方法为:塑料透明胶带拉开10-15cm，胶面朝上，平放在实验台面上。

带叶柄剪去植物叶片，用滤纸迅速吸干表面水分。

左手捏住叶柄，将叶片正面粘在胶带上。

在粘贴过程中，先将叶尖粘在胶带上，然后将叶片向叶背面弯曲，逐渐向前推移，使叶片正面与胶带充分接触。

为了防止粘贴过程中叶片皱缩，应右手持解剖针，置于叶片与胶带之间进行调整，使叶片平整地粘贴在胶带上。

然后剪去叶柄。

将胶带对折过来平整地粘贴在叶片的背面。

然后用手指对捏胶带，使胶带与叶片的两面充分粘着。

将对折的胶带撕开，叶片的正面仍紧密贴在胶带上，叶片的背面与胶带分离，并将叶片下表皮粘贴在胶带上。

若叶面附着物较多，胶带不能与表皮紧密粘着时，可用胶带连续重复粘贴叶片，直到粘去附着物后，粘取下表皮。

为了防止粘取的表皮材料相互重叠，在连续重复粘贴时，应更换胶带新的部位粘着表皮。

将带叶片下表皮的胶带沿表皮轮廓剪成3mm×5mm的矩形片。

在载玻片上滴1滴蒸馏水,将带叶片表皮的胶带胶面向下放在载玻片上,盖上盖玻片，压平后镜检。

气孔密度及大小的测定：采取“印痕法”在叶的背面，避开主脉及边缘，先用胶带把叶片上的表皮毛粘净，然后再涂一层薄而均匀的无色指甲油，面积大约1cm2，待指甲油干后，用胶带取下用于制片，将制成的片子置于10×10T的生物显微镜下观察，每个片随机观察10 个视野，记录每个视野的气孔总数，并随机测定5个气孔的纵径和横径，最后计算出平均密度（1个视野内，r=0.91mm）、纵径和横径，并进行差异显著性分析。

气孔数目的统计方法：在显微镜下计算视野中气孔的数目，移动载玻片在表皮的不同部位作同样的气孔计数，连续计数4～5次，求其平均值。

然后，用镜台
测微尺量得显微镜视野的直径，其半径r则为已知，计算出视野面积S=3.14r2，根据观察所得的各个平均值分别求出每种植物上下表皮的气孔密度，单位为“气孔数／mm2”。