家鸡母子心肌细胞线粒体DNA的提取、鉴定及母系遗传的初步研究

目前研究的现状：
线粒体是真核生物细胞内的一种重要而独特的细胞器，1850 年被发现，1898 年命名。

它是氧化磷酸化和形成ATP 的主要场所, 其作用是为细胞提供“动力”，进行能量转换，供给细胞行使各种生命活动所需要的能量并参与脂肪酸的合成及某些蛋白质的合成。

因此, 对大多数真核生物来说，线粒体是一种不可缺少的细胞器。

同时，线粒体能够携带自己的遗传物质, 并有自己的遗传密码, 这就使得线粒体与其它一般的细胞器不同。

研究证实，线粒体基因组具有编码一系列重要生物学功能的基因，它们不但编码核糖体和生物氧化链上某些重要酶的部分亚基, 而且与真核细胞的抗药性、细胞的生命周期、植物的胞质雄性不育有关。

由于线粒体DNA 具有快速进化、缺少重组以及严格母系遗传等特点, 加之在多数真核生物中，线粒体基因组较小、易于测序及分析。

因此，目前线粒体DNA 已成为人们对生物物种的比较遗传学与系统学研究的理想工具。

近来，随着人们对线粒体DNA 的深入研究，发现线粒体基因与人类的一些疾病密切相关，并可在探索诊断疾病上发挥特殊作用。

如美国研究人员发现，人类细胞中线粒体内的突变与许多癌症有关，通过检测相关体液可以探测到这些突变，从而诊断出癌症，线粒体DNA 的突变会导致氨基糖甙类抗生素致聋；线粒体基因的变异重排与人类衰老有关等。

对线粒体及其遗传物质的研究所取得的成果激起了人类对研究线粒体及其基因组的极大兴趣。

当前，对线粒体基因组研究的热点包括线粒体DNA与核基因的相互关系；线粒体DNA 的信息、结构、功能、遗传；线粒体DNA 在系统进化中的应用；不同生物线粒体基因组的进化等。

国内外对线粒体DNA( mtDNA) 进行了大量的研究，取得了丰硕的成果。

线粒体DNA( mitchondrial DNA, mtDNA) 是动物体内唯一存在的核外遗传物质，它具有拷贝数多、突变率高、进化速度快等特点, 线粒体DNA 为闭合环状双链结构，无组蛋白，分子大小在14- 42kb 之间, 绝大多数介于16- 18kb。

近年来线粒体DNA 的研究已成为分子进化、生物分类、群体遗传结构及亲缘关系鉴定等领域的研究热点，而有效的mtDNA 的提取方法则是开展这些方面研究的必要前提，关于动物mtDNA 的提取方法，在家畜、鱼类等方面报道的较多, 而从禽类脏器中提取mtDNA 的报道尚不多见，本实验对提取mtDNA 中操作手段有所改进和优化，建立了一套较为方便的大量制备禽类mtDNA 的方法，并对影响线粒体DNA 提取产量和质量的因素进行了初步探讨。

线粒体基因组不仅是研究DNA结构与复制转录的良好模型，也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。

线粒体基因组与核基因组的同源基因结构对比也被广泛应用于核基因和核外基因的进化研究中。

由于线粒体基因在真核生物具有高保守性，所以它已成为了研究物种进化的一种常用的标记，并为线粒体起源提供有价值的线索。

动物线粒体DNA具有分子量小、结构简单、母性遗传和进化速度快等特点，已广泛应用于动物群体遗传学和进化生物学等领域的研究。

进行动物线粒体DNA方面意义重大。

线粒体基因组的特点
（1）基因排列紧凑，高效利用DNA，除控制区有非编码区存在外，其余都为基因编码区，内含子序列很少，因而mtDNA的任何突变都可能影响到基因组中的一个重要功能区域。

（2）mtDNA的突变率高于核中DNA，并且修复效率低，即缺乏有效的DNA 损伤修复机制，有些突变还有累加效应
（3）mtDNA为母系遗传，随细胞质进行，所以称核外遗传。

（4）部分mtDNA 的密码子不同于核内DNA 的密码子
（5）缺少终止密码子，仅以U 或UA 结尾
（6）由原有的mtDNA为模板进行复制，但它的DNA功能在很大程度上受核基因组基因的控制，mtDNA复制、重组、转录等过程所需的酶都是由核基因编码的
（7）mtDNA的异质性细胞中mtDNA 突变会导致一个细胞中同时存在两种类型的mtDNA。

异质性细胞在连续分裂的过程中会使突变型和野生型比例发生改变。

mtDNA中存在多态现象，两个无关个体的mtDNA 碱基平均相差3%，这些差异大多为中性的，不改变氨基酸排列，多态性集中在D-环，其他区域则高度保守。

已有的mtDNA提取方法概括起来可分为密度梯度离心法、酶消化法、柱层析法、氯化铯超速离心法、碱变性法、DNase法、Triton法和改进高盐沉淀法等。

本实验集合几种方法对mtDNA进行纯化。

主要研究内容：
从家鸡心肌细胞中提取出mtDNA,进行纯化，之后对其进行鉴定，并初步的研究母系遗传现象。

研究思路与方法
实验流程如下：
家鸡的处死——去心脏——线粒体的游离——线粒体的粗提——mtDNA的提取——线粒体的鉴定
具体实验步骤
1、家鸡的处死，去心脏
取一只母鸡和它的一只子代家鸡，分别将家鸡侧卧于解剖盘中，用力压住家鸡的肋部，使其窒息而死。

将处死的家鸡腹部向上放于解剖盘中，拔掉颈、胸、腹部的羽毛，用剪刀沿腹中线向前剪开皮肤，在胸腔前部的胸骨背面取出心脏，备用。

2、线粒体的游离
用匀浆缓冲液即SE缓冲液（0.25mol/L蔗糖、30mmol/LTris-HCl、10mmmol/L Na2EDTA、2.5mmol/L CaCl2、pH：7.3-8.1）冲洗家鸡心脏，剪碎，后加入约100ml缓冲液，用匀浆机低温1500r/min匀浆20次（为了弄清楚匀浆的次数，需先进行预实验，把不同匀浆次数所得的样品用詹纳斯绿B染色后分别在显微镜下镜检，以游离线粒体较多、细胞核未破裂、完整细胞少为最好，此处只是先提供一个值）。

3、线粒体的粗提
将匀浆液过滤，4℃1500r/min 离心10-15min ，取上清，至于EP管中，4℃12000r/min离心20-30min。

重复以上操作，得到的沉淀即为线粒体，所得沉淀用SE缓冲液悬浮，即为较纯净的线粒体。

4、mtDNA的提取
（1）、改进高盐沉淀
取细胞沉淀，加入溶液I 5500μl ，混匀，2000 r／min ，离心10 min，弃上清。

沉淀加溶液Ⅱ5500μl，混匀，5000r／min ，离心10 min，弃上清。

沉淀加溶Ⅱ950μl 混匀后加入20 mg／ml 蛋白酶K 50μl和10% SDS 120μl，快速混匀，40℃过夜或50℃4 h 。

加入300μl饱和醋酸钠，混匀，轻摇15sec，15000 r／min 4℃，离心15 min ，取上清于Eppendrof管中上清中加入等体积酚：氯仿：异醇（25：24：1) 温和振荡8 min 10000 r／min 4℃离心10 min，取上层水相重复该过程抽提一次，轻取上层水相，加入2倍体积冰乙醇或等体积异丙醇，冰浴30 min ，15000 r／min 离心，10 min弃上清，用70﹪冰乙醇漂洗沉淀，15000r／min ，离心2min，彻底去上清，沉淀于空气中自然干燥25min，加入适量RTE液溶解，所得即为mtDNA，4℃贮存。

（所用溶液（1）溶液I：含Tris-HC1 10mmol／L，NaC1 10 mmol／L MgC1 25mmol／L pH7.5。

（2）溶液Ⅱ：含Tris-HC1 10mmol／L，NaC1 400mmol／LEDTA 2mmol／L pH8.0。

）
（2）、柱层析法
采用羟基磷灰石柱层析对mtDNA进行进一步提纯。

将相当于1克干粉之2克湿羟基磷灰石悬浮于20毫升8M 尿素、0.24M磷酸盐缓冲液pH 6.8 中。

将悬浮液注人直径3厘米的层析柱中。

待羟基磷灰石沉降形成柱层后, 再以8M尿素、0.24M的磷酸盐缓冲液平衡。

将上步得到的mtDNA溶液加入8.9倍体积的0.9%SDS、9M尿素、0.27M的磷酸盐缓冲液pH6.8，混合后上柱，流速为0.5-1.0毫升/分钟。

以紫外光检测仪检测（260nm）出现的第一个宽的峰为RNA和蛋白峰。

上样后以8M 尿素、0.24M磷酸盐缓冲液pH 6.8洗柱，使峰降为0。

再用2
倍柱体积的0.01M磷酸盐缓冲液pH 6.8将尿素洗净。

然后用0.5M磷酸盐缓冲液pH 6.8洗脱，此时在紫外光检测仪检测上出现的第二个锐利的峰即为mtDNA的洗脱峰，收集备用。

（3）、透析去盐、浓缩干燥
将透析袋放入盛蒸馏水之烧杯中煮沸30分钟，加入所收集之洗脱液，扎紧后放入一盛PEG 20000
之平皿中在,4℃冰箱中放置2小时左右，进行浓缩。

浓缩后,以蒸馏水将透析袋周围的PEG冲洗千净，重新扎紧, 再放人500毫升50mmol／L Tris-HC1 pH 8.0，1mmol／LEDTA 缓冲液中, 放置在4℃冰箱中每4小时更换一次缓冲液, 前后共更换三次。

透析后, 将样品（约2 毫升）移入离心管中，加0.2毫升（1/10体积）3M醋酸钠,10毫升无水酒精,混匀后-20℃冰箱中放置4小时,5000转/分离心40分钟。

将上清倒掉, 加70%酒精10毫升漂洗一次, 离心5分钟, 将上清倒掉, 真空泵抽干20分钟。

-20℃冰箱中保存, 用时按所需之浓度加缓冲液溶解。

5、线粒体的鉴定
用0.7- 0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳分析
制备0.7- 0.8%的琼脂糖凝胶，将琼脂糖凝胶倒入电泳板上凝聚，加入电极缓冲液，调电压和时间、温度，上样加入预先处理好的mtDNA样品，母鸡的mtDNA、子代鸡的mtDNA分别加2个泳道，Marker选择含有标准家鸡mtDNA的混合DNA，加在中间泳道。

电泳后照相观察结果。

6、母系遗传的初步研究
分析家鸡的电泳图，计算其分子量，并比较母鸡的mtDNA和子代鸡的mtDNA，看两者的差距有多大，以此来分析母系遗传现象。