仪器分析方法在食品微生物快速检测方面的应用_缪佳铮

缪佳铮，张虹*

（浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310035）

仪器分析方法在食品微生物快速

检测方面的应用

作者简介：缪佳铮（1983—），女（汉），在读硕士，研究方向：食品质量与安全。

*通讯作者：张虹（1962—），女（汉），博士，教授，研究方向：食品质量与安全、功能性食品、水产品开发。

摘要：

从食品安全的角度出发，系统地介绍几种检测微生物的仪器分析方法，包括气相色谱法（GC ）、高效液相色谱法（HPLC ）、毛细管电泳（CE ）技术和质谱（MS ）技术等，以及它们在食品微生物快速检测中的应用。这些方法与传统方法相比具有简单、快速、特异性强等特点。随着科技的进步，必将有更多的仪器分析方法应用到食品微生物检测中，在食品微生物快速检测鉴定领域开辟一个新的应用时代。关键词：

食品安全；微生物；分析检测RAPID DETERMINATION OF FOOD MICROORGANISM BY INSTRUMENTAL ANALYSIS

MIAO Jia-zheng,ZHANG Hong *

（College of Food Science and Biotechnology Engineering,Zhejiang Gongshang

University,Hangzhou 310035,Zhejiang,China)

Abstract:This review systematically introduce several kinds of instrumental analysis methods for microorganism,as well as the application of these methods in food rapid microbial identification.These methods include gas chromatography (GC),high performance liquid chromatography (HPLC),capillary electrophoresis (CE)and mass spectrometry (MS),https://www.360docs.net/doc/e912696089.html,pared with the traditional methods,instrumental analysis are more simple,rapid and precise.With the development of science and technology,more kinds of instrumental analysis methods will be applied to food microbial determination,which takes a new era of application of food microbial determination and identification.

Key words:food safety;microorganism;analysis and determination

食品是人类赖以生存和发展的物质基础，因此，食品安全关系到国计民生和人体健康。目前，食品安全形势不容乐观，根据WHO 统计，全球每年有近15亿人感染食源性疾病，其中70%是食品中微生物污染引起的。通过检测食品中的微生物，可以加强食品安全，有效防止食源性疾病。传统的微生物分析检测方法存在操作繁琐、时间长、灵敏度低、出现假阳性等缺点。因此，寻求快速、准确以及灵敏的微生物分析检测方法已成为全球热门焦点。目前，常见的微生物分析检测方法包括生化检测技术、免疫学技术、PCR 技术以

及基因芯片技术等，仪器分析方法应用相对较少。本文着重从仪器分析角度介绍几种微生物的分析检测方法。

1气相色谱法（GC ）和高效液相色谱法（HPLC ）在微生物检测和分析中的应用

气相色谱和高效液相色谱的分析应用到微生物

的检测中，主要是依据不同微生物的化学组成或其产生的代谢产物各异，利用上述色谱检测可直接分析各种体液中的细菌代谢产物、细胞中的脂肪酸、蛋白质、氨基酸、多肽、多糖等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

其中气相色谱应用较多，该方法简单快速。其原理是将微生物细胞经过水解、甲醇分解、提取以及硅

烷化、甲基化等衍生化处理后，使之分离尽可能多的化学组分供气相色谱仪进行分析。不同的微生物所得到的色谱图中，通常大多数的峰是共性的，只有少数的峰具有特征性，可被用来进行微生物鉴定，大量分析检测各种常见细菌、酵母菌、霉菌等[1]。崔昌浩[2]等建立了气相色谱分析微生物细胞内脂肪酸的方法，分析了As1. 643、As1.1130、As1.1807、HWS、DSM.6577等5种菌细胞内的脂肪酸。结果表明，本方法可以分析细胞内16种脂肪酸。在所分析的5种菌中，最多的含有11种脂肪酸，最少的含有7种。通过对其脂肪酸种类的对比可以分辨出这5种菌种，并且得出了这5种菌的指纹图谱，可对菌种进行鉴定分析。顶空气相色谱法也已广泛应用，通过检测培养基或食品密封系统顶部的微生物挥发性代谢产物CO2，来分析和鉴定微生物。特别是用于分析食品中的酵母菌、霉菌、大肠菌群和乳酸菌的污染程度，以及对沙门氏菌的筛选，对评价食品品质和安全性具有非常重要的意义。该方法具有灵敏度高，检测快速，在101cfu/mL~108cfu/mL范围内线性好等优点[3]。李永峰[4]等利用酸性末端产物气相色谱分析判定产氢细菌，试验结果显示，如果乙醇和乙酸占液相末端产物质量分数95.0%~99.0%，可以认为该细菌是发酵产氢细菌。此外，热裂解气相色谱（Py-GC）在分析细菌方面具有化学分类学价值，可用于实验室检测或鉴定细菌。该法是利用细菌热裂解产生的特有生物标记物，如2-呋喃甲醛、吡啶二羧酸等，进行细菌检测和鉴定。Schmidt H[5]等采用Py–GC/FID对大肠杆菌、藤黄微球菌和巨大芽孢杆菌进行检测，试验结果显示，在保留时间1.5min~28min内，每种菌都有15种特定物质，如大肠杆菌中有革兰氏阴性菌特有的脂多糖裂解产生的十二酸、十四酸和十二醛等，而在藤黄微球菌和巨大芽孢杆菌等革兰氏阳性菌中则不存在。这些物质的峰大多分布在这段保留时间内，但大约有一半大肠杆菌裂解产物的峰保留时间大于20min。根据细菌裂解产物的图谱分析，即可进行菌种鉴定。

高效液相色谱也有较广泛的应用，主要用于对多组分混合物的分离。这种方法不仅使以往的柱色谱法达到高速化，而且其分离性能大大提高。Aguete E C[6]等采用HPLC检测分析饮用水中的蓝细菌毒素，结果显示在0.83mg/L~16.671mg/L观察范围内呈现良好的线性关系，且该方法具有较高的敏感性和选择性。王君[7]等用高效液相色谱法测定食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，能达到完全的基线分离，检出限分别为0.012、0.008、0.036和0.024μg/kg，不同水平的加标回收率均达80%以上，RSD均小于3.0%。该方法快速、准确、灵敏，有利于试验者安全，能同时分离食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2。此外，变性高效液相色谱（DHPLC）可用于致病微生物基因检测，其原理是利用离子配对逆相层析的原理来分析核酸。DHPLC系统对DNA片段的分离是基于其长度，而非序列。若DNA链的长度越长，就带有越多磷酸基团，因此有较多的TEAA与之相结合，使其在柱内保留的时间增长。乙腈具有亲水性，增加流动相中乙腈浓度可将DNA洗脱，达到分离目的。在恰当的变性温度下，谱图上显示明显的吸收峰。该技术具有完全自动化、灵敏度高、经济等优点，可以大大节省工作量，在实验和诊断中得到了广泛应用。如对沙门氏菌的检测，主要是对相关基因225bp~500bp 大小的片段进行PCR扩增，产物直接用DHPLC检测，突变基因显示特征峰型[8]。上述各项技术具有快速、敏感、精确等特点可广泛应用于食品微生物的检测分析中。

2毛细管电泳（CE）技术在微生物分离分析和检测中的应用

在过去的20多年间，毛细管电泳技术取得了显著的进步。包括所谓的伪固定相技术如胶束电动毛细管色谱（MEKC）与较近期发展的微乳液电动色谱（MEEKC）和真正使用固定相的电泳技术如毛细管电色谱（CEC）等。这些技术的最大优势在于两个相辅相承的分离原理，即色谱和电泳机制[9]。

毛细管电泳是泛指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异而实现分离的一类分离技术。CE与传统的平板电泳方法相比，具有分离柱效高、分析速度快、自动化程度高、分析对象广、分离模式多等特点[10]。毛细管电泳已广泛应用于食品微生物的分析检测中，与GC 和HPLC方法相比，具有样品前处理相对简单、无需提取物和方法发展相对快等优势[11]。

CE能将细菌当作“离子”看待，细菌在一定的生理条件下，其表面基团的电离状态和双电层的厚度是电泳缓冲液种类、pH值、离子强度和温度等参数的函数，可以通过优化这些参数分离不同种类的细菌。CE 理论指出，分离柱效随样品分子扩散系数或分子量的增大而上升，这就预示着CE在细胞分离中具有独特的优势。如Yamada[12]等分别采用毛细管区带电泳和毛细管凝胶电泳两种模式对单独和混合培养的强壮纤维单胞菌和根癌土壤杆菌进行了分离。混合菌液经电泳分离后分别收集，经毛细管区带电泳分离后两种菌纯度均在90%以上，而经毛细管凝胶电泳分离后纯度

均达98%以上。

CE以细菌表面的特征信息为分析分离的基础，因而CE能反映细菌的特征信息，如基因表达产物在表面积累(表面展示)，特殊时期生理特征。据报道，Ebersole和McCormick用CE对粪肠球菌、化脓链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌5种细菌进行了分离，发现不同发育阶段的菌体细胞对应着不同的特征峰，而且大多数细菌在电泳后仍能保持活体状态，活体细菌在线检测可为微生物分析提供新的快速分析方法[13]。

蓝细菌是引起饮用水毒性污染的主要原因，可以通过检测蓝细菌毒素来分析鉴定饮用水的食用安全性。Aguete E C等分别采用毛细管区带电泳（CZE）、胶束电动毛细管色谱（MEKC）和毛细管等速聚焦电泳（CITP）分析检测饮用水中的MC-RR、MC-YR和MC-LR3种蓝细菌毒素。结果显示，在各自一定的柠檬酸缓冲液浓度和pH条件下能够将上述3种蓝细菌毒素有效分离，且胶束电动毛细管色谱是最有效的一种方法。

毛细管电色谱(capillary electrochromatography, CEC)是近年来发展十分迅速的一种新型分离技术。目前，对于其在蛋白质、多肽以及其它生物分子方面的探索引起了人们的兴趣[14]。它是在毛细管两端施加高电压，以电渗流(EOF)作为流动相的推动力，根据样品中各组分在固定相和流动相间分配系数的差异以及在电场中迁移速率的不同而实现分离的一种高效微分离技术，是高效液相色谱法和高效毛细管电泳的有机结合[15]。它不仅克服了液相色谱中压力流本身流速不均匀引起的峰扩展的问题，而且峰扩展只与溶质扩散系数有关，从而获得了接近于毛细管电泳水平的高柱效，同时还具备了液相色谱的选择性。CEC采用高压直流电源代替高压泵，用电渗流来驱动流动相，流速在管中不是呈抛物线轮廓，而是呈扁平的塞子流型，因而在毛细管中没有流速梯度，谱带展宽效应十分小，这是CEC比HPLC柱效高的根本原因[16]。

微囊藻毒素由各种蓝细菌产生，是新鲜饮用水中的重要污染物，与人类健康密切相关。因此，对饮用水中微囊藻毒素的检测是极其重要的。毛细管电色谱是一种非常有效的微囊藻毒素分析方法，结合紫外检测能够有效取代以往采用的高效液相色谱法。Marta Zeisbergerova[17]等采用实验室自制的反相毛细管柱，在给定条件下得到了与高效液相色谱分析一样的微囊藻毒素洗脱顺序。而且，毛细管电色谱分析对样品数量要求少，在较短的时间范围内能够对微囊藻毒素进行有效分析，是一种快速分析方法。3质谱技术在微生物检测和鉴定中的应用

传统技术对于微生物的检测和鉴定周期较长（数天时间），并且灵敏度低，特异性差。近期快速发展起来的质谱（MS）凭借其诸多优点已成为一种新型分子水平技术[18]。一个微生物的质谱鉴定实验，包括样品的采集和制备，整个过程不到10min。此外，质谱还是一种通用技术，它可以检测到所有类型的病原体，包括病毒、植物细菌、真菌及其孢子、寄生原生动物，并且需要样品量很少，可少于104个微生物。

目前采用质谱检测和鉴定微生物主要基于质谱图中是否存在特异性生物标记物的分子离子。因此，不同微生物具有不同的质谱图，即微生物指纹图谱。采用新型的质谱软电离方法，如基质辅助激光解吸电离(MALDI)和/或电喷雾（ESI），可获得微生物的质谱图。为了鉴定微生物，可将实验得到的质谱图与已被编入质谱指纹图库中的已知微生物的指纹图谱进行比对。最近人们提出了一种基于生物信息学策略的微生物质谱鉴定方法[19]。当对应生物体的基因序列已知时，可根据可能表达的蛋白质序列来预测质谱图中是否存在蛋白生物标记物。无论采用bottom-up还是top-down蛋白质组学策略，利用二级质谱技术鉴定出一个或多个独特的蛋白生物标记物后，就可以鉴定出微生物。Mortz等率先利用FTICR-MS/MS通过推断氨基酸序列和蛋白质组数据库搜索实现了对完整蛋白的鉴定。样品经提取、分级和处理后，采用该方法，利用高分辨率的二级FTICR质谱分析，找到了利用MALDI-MS从完整的B.cereus T孢子中发现的主要生物标记蛋白，即小的酸溶性孢子蛋白（SASP）。通过TOF/TOF 的检测，鉴定出各自的生物标记物SASP后，就可以在二元混合物中鉴别出完整的B.globigii和B.cereus 孢子[20]。

MALDI-TOF-MS是一种强大的分析工具，由Karas和Hillenkamp在1987年首先提出，其优点是灵敏度高，分析时间短，解吸完整分子的质量高达500000u，在快速鉴定检测微生物方面有很多潜在的应用，如食品中致病菌的检测等[21]。Claydon系统研究了多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的全细胞MALDI-TOF-MS质量指纹图，但研究的重点放在质量数为550~2000的小分子量区域。在这一区域，所研究的革兰氏阴性菌都有一系列质量数相差129的质谱峰，这可能是肽聚糖逐步失去戊糖或谷氨酸的产物，而革兰氏阳性菌中没有观察到这些离子，这可以作为MALDI-TOF-MS鉴定革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的指标。Domin研究小组以大肠杆菌为试验对象，考察

了不同基质和蛋白提取溶液对质谱图中峰强度的影响，发现用17%甲酸，33%异丙醇和50%水提取蛋白后，以1:1的2-(4-羟基苯偶氮)苯甲酸和2-巯基苯并噻唑作为基质可以获得最好的质谱信号[22]。Ishida[23]等通过MALDI-TOF-MS分析细胞膜的磷脂，对肠杆菌科中的4个菌种进行了鉴定。目前MALDI-TOF-MS 用于细菌脂类脂肪酸分析的研究较少。George W Jackson[24]等则采用质谱通过分析16rRNA裂解产物进行细菌种类鉴定。

4结语

民以食为天，食以安为先。面临日益严峻的食品安全形势，我们亟需快速、有效的微生物检测技术和方法，而仪器分析方法是一种相对精确简单的方法。目前，国外仪器分析技术较为先进，应用较多的有气相色谱、高效液相色谱、毛细管电泳以及质谱技术等，并已广泛应用到食品检测分析领域中，而国内应用相对较少。随着科技的进步，将会有越来越多的食品微生物分析方法和技术应用到生产实践和生活中，如液质联用、气质联用、多级质谱、高效液相—毛细管电泳技术联用等，必将在微生物快速检测鉴定领域开辟一个新的应用时代。

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收稿日期：2008-03-17