亚甲蓝

抗菌化学疗法

亚甲蓝-介导光动力灭活-一种新型肠道病毒消毒剂

目标：测试亚甲蓝-一种安全价格合适的光敏剂能否在环境中，对EV71进行光动力灭活。

方式：通过增加光剂量及光敏剂的浓度，在试管内观察对EV71及其他肠病毒的光灭活作用。在新生幼儿活的机体内模拟病毒在环境中的传播。处理后改变病毒DNA及蛋白质分析可能的方法。

结果：在悬液中对EV71的光动力灭活取决于剂量。有亚甲蓝时，光灭活EV71的最

佳条件是光剂量为200J/cm²。该种光动力条件还能够灭活其他肠病毒包括脊髓灰质炎病毒及柯萨奇A2， A3，A16与B3病毒。在一个模拟环境中，在硬表面上传播的

EV71被亚甲蓝为媒介的光动力灭活并能阻止EV71传播到老鼠身上。蛋白质痕迹与反

转录酶-聚合酶链锁反应分析表明病毒蛋白质与染色体在光动力灭火后都受到了破坏。

结论：亚甲蓝为媒介的光动力灭活能够提供一种新的根除EV71环境污染源的方式预

防感染。

关键词： EV71，光动力疗法

简介：

EV71是一种单核醣核酸无包膜病毒，是小病毒家族肠道病毒属。大部分的EV71感染

并不是致命的，例如在小孩之间传播的手足口病及疱疹性咽峡炎。但是中枢神经感染

的话，会出现致病的肺部及心脏并发症。自从脊髓灰质炎病毒得到有效控制以来

EV71就被看作是最重要的嗜神经肠道病毒。据报道导全世界已经发生十几起EV71爆发。首例是在1969年加利福尼亚被确认的。 EV71病毒能够抵抗70%的酒精消毒，

该病毒认为是经口粪传播。在日托机构，幼儿园，学前班等机构鼓励勤洗手防止EV71

感染。不过该种做法肯定不会减少环境中的微生物。公共场合及医院硬物体表面消毒

剂最常用的是过氧乙酸与氯化物。但是此类消毒剂有遗传毒性及致癌性，对环境及人

类有毒，对蹒跚学步小孩尤其有害，因为他们经常在地上爬并且舔手。

光动力疗法已经被应用到摧毁癌细胞及各种各样的微生物包括病毒与细菌，在有氧气

的条件下，通过将光敏剂与光结合。亚甲蓝是一种噻嗪化合物，几十年以来亚甲蓝手

术中细胞染色，肿瘤边缘描绘，同时还被用作硝酸盐毒及高铁血红蛋白血症的解毒剂。在光动力疗法中亚甲蓝还被用作光敏剂。亚甲蓝能够吸收620nm到670nm的可视光。在光激活后，其可以产生纯态氧及氧自由基，通过破坏或交联核算及蛋白质灭活病毒

及细菌。以亚甲蓝问介导的光动力疗法已经被应用到血液制品消毒因为其安全性高，

价格低，残留物少，凝血因子减少量小。

在此次研究中，我们通过在悬液中及硬物体表面观察亚甲蓝光灭活EV71的效用来调查将亚甲蓝光动力疗法用作环境消毒剂的可能性。

材料及方式

细胞及病毒

横纹肌肉瘤细胞（美国型培养菌种集，马纳萨斯，维吉尼亚州，美国）放在含有10%小牛血清细胞培养基中2mml 谷氨酸盐，盘尼西林以及链霉素。 EV71病毒原液（基

因库进入码 AF 304458）, 小鼠适应株 EV71 MP4，柯萨奇A2病毒（CA2），柯萨奇

A3病毒（CA3）, 柯萨奇A16病毒（CA16），柯萨奇B3病毒（CB3）以及脊髓灰质

炎病毒1型病毒（台湾，台南国立成功大学）在横纹肌肉瘤细胞中进行培养。

在固体表面光灭活EV71

在一个恒温（28℃）相对湿度恒定的（相对湿度：50%，70%以及90%）。试验箱

内每隔4小时观察病毒在固体表面存活情况，观察3天将10微升病毒悬液（4.7×

105pfu）放到一个没有遮盖的24孔培养板上。用100μl的培养基反复吸量恢复活性

病毒然后用噬菌斑测定量化。为了灭活固体表面EV71，将10μl的病毒悬液加到24

孔培养板上，在28℃下及70%相对湿度下培养24小时。亚甲蓝直接作用到病毒膜上，为淡粉色圆点很好辨认。培养板立即在LED光源下进行照射，不用遮盖，照射率为27.8mW/cm2. LED光源是由一系列都得由234LEDs构成按18×13排列。光功率的均

匀性通过光功率计进行确认。在一侧会放置一台电风扇，在照射过程中打开电风扇防

止热效应。活性病毒得到恢复。

噬斑试验

在24孔培养板上准备好成片横纹细胞瘤单层细胞。细胞被连续稀释的病毒悬液感染，被培养基中的15%的甲基纤维素覆盖，该培养基含有2%胎牛血清，在斑块呈现结晶

紫之前，在37℃下培养3天。噬斑试验的检测限值＞10pfu/mL.

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质印迹

为了检测光动力疗法对病毒蛋白质的影响，在病毒悬液中加入亚甲蓝最终的混合物中

含有12或60μg病毒蛋白质以及0,0.5 或50μm的亚甲蓝。在照射之前，12μg的EV71病毒蛋白（3.15μl）与3.5μL的亚甲蓝（0,5,50或是500μM）一起培养10分

钟或是60μg的病毒蛋白（157.5μL）与17.5μL的50μM的亚甲蓝一起培养10分钟。在照射后，将20μl的混合物（包含7μg的EV71的病毒蛋白）与加样缓冲液混合，在被十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后被转移到聚偏二氟乙烯膜之前，

在90℃下培养15分钟。膜会被3%的脱脂牛奶封住用EV71免疫血清沾染（1:500

稀释），之后用辣根过氧化物酶共轭山羊抗小鼠免疫球蛋白（1:5000稀释）。使用DAB显色试剂盒。噬斑试验显示亚甲蓝光动力疗法后没有检测到活病毒。

逆转录-聚合酶链反应

将病毒核糖核酸从病毒悬液中提取出来，有或没有亚甲蓝光动力疗法，转化成为互补DNA。在3μL互补DNA样品上进行聚合酶链式反应扩增。

缚于物体表面的EV71到鼠的传播

为了模仿EV71在环境中的传播，将1ml的病毒悬液（3×103, 3×105,3×107pfu）或

者是培养基与吐温20预先混合（0.1% 最终浓度；），通过慢慢旋转使其均匀地分散

在75ml 长颈瓶的底部。长颈瓶的顶部已经被移开便于动物操作及照射。出生一天的小鼠禁食三小时后放入长颈瓶中（每个长颈瓶6只）。长颈瓶顶部用聚乙烯薄膜封住，

盖子轻轻盖上便于空气交换。在室温下，将小鼠放在长颈瓶中4小时，之后放回原处

每天观察其体重变化及存活情况。使用过量戊巴比妥钠， 1 或者2个周后，所有的动