秋水仙素

植物多倍体的诱导与鉴定
摘要本试验以大蒜鳞茎作为试验材料，通过使用不同浓度的秋水仙素进行诱变处理，以期获得多倍体的植株。

之后通过植株的形态指标测定，干湿重测定，气孔鉴定，染色体计数等鉴定倍性。

结果表明，0.05%和0.1%浓度的秋水仙素处理24h，有使植物染色体加倍的作用，达到诱导植物多倍体的目的。

相比较而言0.05%浓度的秋水仙素致突变率较高。

且结果显示，0.1%浓度秋水仙素具一定毒害作用，抑制植株的生长。

本次试验使个人掌握了人工诱导多倍体的原理与方法。

倍性育种作为一种快捷的育种方法，创造出的多倍体植物通常具有植株粗壮，花朵硕大，花期长适宜性增强等特点，而且同源多倍体还可以克服远源杂交不育的弊端，形成性状稳定的新品种。

因此，倍性育种在现代植物育种中具有主要地位和广阔前景。

天然多倍体发生频率低，数量有限，不易发现和选择，难以挖掘利用。

随着植物育种技术和多倍体诱导技术的发展，人们常利用人工诱导的方法提高多倍体的发生频率，从而创造植物多倍体类型。

目前，已有研究的有植物多倍体人工诱导技术，各种植物诱导的最好的诱导技术与条件，植物各特征与倍性的关系等等。

[1]
本实验以不同浓度秋水仙素为诱变剂，对大蒜鳞茎进行诱变处理。

植物多倍体人工诱导方法主要可分为物理诱导法、化学诱变法、胚乳培养法和细胞融合法等。

其中秋水仙素是应用最广且效果最好的化学诱变剂。

秋水仙素的作用在于当它与正在分裂的细胞接触后，可抑制微管的聚合过程，使细胞中的纺锤丝合成受阻，从而阻止染色体向两极移动，形成染色体加倍的核。

适宜浓度的秋水仙素能阻碍正在分裂的细胞纺锤丝形成，但对染色体的构造无明显影响，仍然保持细胞的活性，细胞经处理后在一定时间内即可恢复正常分裂能力。

对植株的倍性鉴定，本试验采用中期染色体计数，生理生化指标的测定，植株形态指标测量进行。

本试验通过秋水仙素诱导植物多倍体，各方法鉴定倍性，研究了不同浓度诱变剂对植物的诱变作用，秋水仙素的毒害作用。

熟悉人工诱导多倍体的原理，初步掌握用秋水仙素诱发多倍体的方法。

掌握植物多倍体细胞染色体加倍的特点及染色体制片的一般方法
1 材料与方法
1.1 种子来源
正常，均大的大蒜鳞茎。

1.2 实验处理方法
1.2.1 大蒜种子先用清水浸泡12小时，催根芽萌动后倒掉水分，分别浸在0.05%，0.1%的秋水仙素溶液24小时(浸没种子的2/3)。

另有一组为对照组，浸
在蒸馏水中处理相同时间。

处理种子时使用培养皿，下面铺上滤纸或双层纱布保湿。

1.2.2 24小时后，取出种子，用自来水冲洗种子及根2－3次以去除残留的秋水仙素。

将萌发种子移到清水中培养发芽。

种子根尖长到1cm左右时后取出幼苗盆栽。

栽种前取1～2颗种子的10余个根尖固定后保存于70％乙醇中，用于观察中期染色体加倍情况。

1.2.3 把处理后的幼苗栽种在盆钵内，同期栽种未经处理的的种子作为对照。

（每小组一个长条形盆，栽种时土与肥料比例约5：1）
1.2.4 栽种期间给以良好的管理。

定时浇水，每日给予长时间的日照。

1.2.5 处理组与对照组形态及生理生化指标的测定与比较。

（待对照组长至株高15-20cm时，测定生理生化、形态指标。

）
1.3 观察方法
1.3.1 中期染色体观察
1.3.1.1取出早期保存于乙醇中的根尖，投入卡诺氏固定液中固定15min。

1.3.1.2取固定保存的材料放置1N盐酸中于60℃的水浴温度下，处理6～8分钟，至透明为止。

1.3.1.3用清水冲洗干净解离液。

1.3.1.4取洗净的材料，放在载玻片上，用改良品红染色10min。

然后将材料移至另一清洁的载玻片上。

重新用染液装片，覆以盖玻片，以铅笔的橡皮头端轻轻压盖玻片，使材料呈现分散的薄层，置镜下观察。

1.3.2 形态观察测量
测定各实验组植株的株高，根数，根长，叶长，叶宽的数值。

每组随机选取3株健壮的植株测量。

其中，株高为自植株基部至顶端的自然高度；叶长为从叶柄到叶尖顶端的长度，本试验统一选用植株的中部进行测量；叶宽为垂直叶柄的宽度。

1.3.3 生理生化指标测定
1.3.3.1 萌芽率统计
1.3.3.2 植株干、湿重测定
1.3.3.3 叶片气孔大小与密度
待植株地上部分达15cm长，9：00am 时，每组随机选取3株健壮的植株观察，每株植株选取幼嫩叶片3片，撕取叶片下表皮置于载玻片上，滴 1 滴蒸馏水，盖上盖玻片，显微镜下观察气孔保卫细胞。

分别统计3个不同视野的气孔个数。

2 结果
2.1 中期染色体计数
图一对照组鳞茎根尖细胞的染色体(10*40)
图二 0.05%秋水仙素处理的根尖细胞的染色体(10*40)
图三 0.1%秋水仙素浓度处理的根尖细胞染色体(10*40) 图一为对照组未加倍的大蒜鳞茎根尖细胞染色体数目为2n=16，为二倍体。

图二为用0.05%秋水仙素处理24h后的大蒜鳞茎根尖细胞，染色体数目为2n=32，染色体已经加倍。

可以确定该实验组的植株为四倍体，染色体数目是二倍体的两倍。

图三为用0.1%秋水仙素处理24h后的大蒜鳞茎根尖细胞，大部分细胞染色体数目为2n=16，未加倍，仍为二倍体。

少量细胞染色体数目为2n=32，为四倍体。

可见，较低浓度的秋水仙素处理24h能够有效是细胞染色体加倍，但较高浓度下，如0.1%浓度的秋水仙素处理相同时间加倍作用较弱。

浓度植株株高（cm) 根长（cm）根数叶长（cm）叶宽（cm）
0 1 5.71 11.51 18.00 14.25 0.81
2 14.0
3 6.03 5.00 11.41 0.71
3 13.41 12.71 20.00 7.18 0.92
4 19.11 10.71 15.00 10.33 0.83
5 10.30 16.23 15.00 9.32 1.02
6 9.31 15.54 25.00 3.92 0.73
7 15.11 5.42 28.00 5.91 0.85
8 9.33 1.67 20.00 3.92 0.74 平均值12.94 11.16 20.14 7.43 0.83
由表一与图中可以得到结果：与对照组相比较，0.05%浓度处理的大蒜蒜瓣生成的植株生长状况较好，除根长、叶宽有较小差距外，株高、根数、叶长数值都较大。

而0.1%浓度的秋水仙素处理的实验组，除根长与叶宽差别微弱外，各组数据都较对照组与较小浓度处理的实验组小，说明生长状况较差。

低浓度的秋水仙素处理得到的多倍体植物表现出的“巨大性”，主要体现在外形较大，叶片宽，叶色浓绿，根数多。

但在较高浓度的秋水仙素处理下，结果相反，表现出植株矮小，根数少。

这可能是因为变异株受秋水仙素的影响，变异机理不同。

也有可能是秋水仙素的毒害作用，抑制了植株的生长。

2.3 生理生化指标
2.3.1 萌芽率统计
表二各浓度处理下种子萌芽率
1 2 3
秋水仙素浓度0 0.05% 0.10%
萌芽率100% 100% 87.50% 有实验数据结果可知，较高浓度的秋水仙素对植物的萌发有影响，可能是因为染色体的过多加倍，会使细胞死亡。

2.3.2 干湿重
表三各浓度处理下植株干湿重
1 2 3
秋水仙素浓度0 0.05% 0.1% 湿重（g）58.99 63.39 51.82 干重（g）30.76 55.14 23.32 干湿重比0.52 0.87 0.45 植株的干湿重比可作为衡量植物生长状况的参数。

由表三数据可知，0.05%浓度实验组的植株生长较好，单位植株重量含营养成分较未变异体多，具有多倍体的性质。

而0.1%浓度处理的实验组数据显示，单位植株重量含营养成分营养成分反而少，说明该组植物生长受到负面影响。

3.3 气孔鉴定
植物叶表皮保卫细胞密度与其叶片细胞大小成反比, 保卫细胞大小与其叶
片细胞大小成正比, 通过观察和测量不同倍性的植物叶表皮上的保卫细胞, 计
算保卫细胞的密度和面积, 分析数据, 从而得出相应的结论。

[2]
图五对照组无处理植株的气孔(10*40)
图六0.05%秋水仙素处理植株气孔(10*40)
图七 0.1%秋水仙素处理植株的气孔(10*40)
表三不同浓度处理的植株叶片气孔密度
视野 1 2 3 秋水仙素浓度0 0.05% 0.10%
气孔密度
1 28 14 27
2 30 12 10
3 15 20 2
4 平均24 1
5 20
与对照组比较气孔密度，可以判断0.05%秋水仙素处理的多倍体植株细胞较大，表现出多倍体的巨大性。

而诱变未成功的0.1%浓度实验组保卫细胞密度与对照组相近。

通过观察，可以发现0.05%浓度实验组的气孔体积较大，可推断该组的植株细胞较大。

因此气孔的密度与体积大小可以作为多倍体鉴定的依据之一。

3 讨论
3.1 结果分析
3.1.1 秋水仙素浓度与植物多倍体诱导的关系
在本次试验中，0.05%浓度处理的实验组经鉴定为多倍体，细胞内染色体为2n=32，表现出了多倍体的巨大型、营养成分含量高等特征。

说明秋水仙素诱导其变异成功。

可以得到结论：0.05%浓度秋水仙素采用浸泡种子的方法处理24h
能够成功地诱变多倍体，但变异率还有待研究。

0.1%浓度处理的大蒜种子出现了萌发率降低，根数减少，植株出现外形矮小，发育不健全的现象。

同时通过倍性鉴定，可以发现0.1%浓度实验组的只有少量细胞染色体发生加倍。

与植株秋水仙素的毒害性较大，如处理不得当，无法使植物细胞加倍的同时，也会对植物外植体材料造成严重的毒害作用，甚至使外植体材料死亡，对诱变效率有较大的影响。

因此我们需要筛选合适的处理浓度及处理时间
3.1.2 秋水仙素的毒害作用
秋水仙素有剧毒, 对植物体有毒害作用, 常常使材料在处理过程中死亡, 而且抑制种子的萌发和根的生长。

高浓度的秋水仙素处理会抑制植株的生长，可能与秋水仙素抑制细胞分化有关。

同时不能忽略处理时间长短的控制。

在秋水仙素处理植株时，还要注意植株的生长条件，尤其是温度条件的控制，低温会阻碍细胞分裂，过高的温度则使秋水仙素对细胞的损害增大，同时也加速秋水仙素的变性。

[3]
3.1.3 嵌合体现象
嵌合体是指具有两种或两种以上基因的植株, 在本次试验中，各个实验组都存在。

可能是因为在处理过程中, 并不是全部分生细胞的染色体数都同样的加倍,。

成功的处理使多数细胞都能加倍,可能的减少未加倍的细胞, 这样才能保证加倍的细胞繁殖；否则受环境干扰大, 并且可能产生回复突变。

这可能与处理时外植体所处的生长时期，或者处理的部位对诱变剂的敏感度有关。

3.2 反思
3.2.1本实验的成功之处
在这次实验中，我们研究了不同浓度相同处理时间对植物倍性的影响，并通过形态观察、生理生化指标测定、染色体计数等鉴定方法对多倍体的初步特征进行了研究。

对秋水仙素作为诱变剂的作用机制有了初步的认识。

并了解了这个诱变方法所存在的问题，如：诱变率不高，容易出现嵌合体；剂量与处理时间的控制，以及其它诸多因素对结果的影响。

3.2.2所存在的不足
在本次试验中，应增加对试验材料变异率的测定，统计各浓度下的细胞变异的比例，可以更主观、直接地研究不同浓度诱导剂的作用强度。

[4]因试验前对文献的阅读不足，没有观察多倍体根部膨大的形态特征，失去了一个直接鉴定多倍体的证据。

在气孔鉴定中，本次试验只获得了气孔密度的数据，对不同秋水仙素浓度处理下的植株叶片气孔的大小没有进行准确的测量。

在鉴定倍性中失去这个有说服力的论据。

[2]
本次试验采用的处理方法为浸泡种子，这个方法的有效诱导效率低, 而且秋水仙素用量太大, 毒害作用最为直接, 同时也可以因缺氧而死亡。

还有待进一步改善处理方法。

[5]
3.3 研究方向展望
因为多倍体的产生, 受植物体的生长状态、倍性水平, 以及秋水仙素的处理时间、浓度、温度和渗透剂的影响, 对秋水仙素诱导多倍体这一项技术, 还需要在更多的植物上开展广泛的研究。

下一步的工作可着眼于如何提高诱变的变异率，研究影响染色体加倍频率的各个因素，如处理的部位，处理时温度、日照，
被处理植物所处的生长时期等。

[3]
另外多倍体除了形态学的特征外，其生理生化特征还有待进一步探索。

参考文献
[1] 王晓桐, 张金凤.大蒜多倍体诱导的探究性实验.青海农林科技.2010年第2期
[2] 章振华,焦燕波,陈铭德.植物细胞大小与植物倍性关系的实验探索.生物学教学.2007年(第32卷)第6期
[3] 郑永强, 徐坤. 秋水仙素在植物体细胞染色体加倍中的应用研究进展.中国农学通报. 2003年10月.第19卷,第5期
[4] 彭静,魏岳荣,盛鸥等.不同浓度秋水仙素对贡蕉的多倍体诱导.分子植物育种，2010 年，第8 卷，第4 期，第752-757 页
[5]王真,陈道明,李春燕等.半支莲多倍体诱导的初步研究及鉴定.广东农业科学.2010 年第8 期。