几丁质酶-蛋白质化学

)
6000 3000 0 -3000 -6000 -9000 190
2
200
210
220 230 (nm)
240
250
260
三、PSC结构表征
结果与分析(PSC)
三级结构
粉色：α-螺旋 黄色：β-折叠 蓝色：无规则卷曲 绿色：酸性氨基酸 红色：活性位点
(βα)8折叠桶
四、PSC营养成分
结果与分析(PSC)
-20 -24
g
-0.008 0 2 4 6 8 10 12 14
-15
300
320
340
360
380
400
CaCl2 (mM)
Wavelength (nm)
-20
-25
Ca2+导致PSC空间构象发生改变。
0
2
4
6
8
10
12
14
CaCl2 (mM)
六、PSC与Ca2+相互作用
结果与分析(PSC)
500
FAO/WHO pattern
Amino acid scores PSC GSG
Thr
Leu Ile Val Phe+Tyr
102.66
104.00 67.828 52.50 155.47
17.61
75.58 42.91 53.95 84.75
23
59 30 39 38
4.46
1.76 2.26 1.3 4.09
2
200
210
220 230 (nm)
240
250
260
PSC-EDTA、PSC以及 PSC-EDTA-Ca的CD光谱
六、PSC与Ca2+相互作用
结果与分析(PSC)
三级结构
UV Spectroscopy 0.002
0.004 0.002 0.000 -0.002 -0.004 0.006
a
0.000
Val
Phe Lys Trp Met
13
11 8 5 2
4.76
4.03 2.93 1.83 0.73
总和
102
37.36
四、PSC营养成分
结果与分析(PSC)
必需氨基酸组成
PSC和葡萄籽球蛋白（GSG）中必需氨基酸组成与FAO/WHO推荐量的比较
必需氨基酸
PSC （mg/g）
GSG （mg/g）
样品 PSC-EDTA PSC PSC-EDTA-Ca
六、PSC与Ca2+相互作用
结果与分析(PSC)
稳定性
0.9 0.8
PSC-EDTA PSC
Abs (280 nm)
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 10 20 30 40 50 60 70 80
5.1 º C
62.2 C
o
67.3 C
o
Temperature(oC) PSC和PSC-EDTA的热变性曲线
六、PSC细胞定位
结果与分析(PSC)
60
组织定位
4-MU concentration (M)
50 40 30 20 10 0
7.7 倍
BSA
Husk Samples
Embryo
六、PSC细胞定位
结果与分析(PSC)
——免疫电镜
必需氨基酸组成
PSC中必需氨基酸组成分析与葡萄籽球蛋白（GSG）、大豆球蛋白（SBG）比较
必需氨基酸 （Eaa） Thr Leu Ile
PSC中Eaa （mol/mol PSC） 25 23 15
Eaa摩尔比（%） PSC 9.16 8.42 5.49 GSG 3.01 8.32 5.06 7.16 3.77 2.00 1.41 30.73 SBG 4.50 8.60 4.30 5.60 5.70 4.50 1.20 34.4
五、PSC中钙结合表征
结果与分析(PSC)
——ICP-MS
PSC (μmol/L) 3.48 ± 0.10 3.28 ± 0.05
结合钙含量测定
样品 PSC PSC-EDTA Ca (μg/L) 1573.02 ± 3.87 114.18 ± 5.68
新发现！
Ca/P SC
ICP-MS测定PSC和PSC-EDTA中钙含量
0.76
1.28 1.43 1.38 2.23
>
Lys
Met+Cys 总和
41.37
35.35 559.17
11.42
14.66 300.88
45
22 256
0.92
1.61 2.18
0.25
0.66 1.18
结果与分析(PSC)
结合金属含量测定
——ICP-MS
ICP-MS对PSC的全定量测定结果
酶学性质
(M )
15mM
6
10mM
4-MU Concentration
200
4 2 0 0
7mM 5mM 4mM
a b c
Activity(fluorescence unit)
400
S Ca2+对于酶活的表征不是 E
E+S
150
5
10
Time (min)
15
20
1/v (s/M)
必需的，且对酶的催化活性 不会产生明显的影响。
金属元素 Mg
分子量 Mw 24
摩尔浓度 （μmol/L） 0.42 ± 0.15
金属/PSC （mol/mol） 0.32 ± 0.11
Ca
Cr
40
52
14.76 ± 0.37
0.00 ± 0.00
11.26 ± 0.28
0.00 ± 0.00
蛋白与钙的精确 计量比是多少？
Mn
Fe
55
57
0.00 ± 0.00
39.355 40.801 41.496 42.975
50
50
Asp-Ca
PSC-EDTA
50.129 52.447 53.941 56.573
50
60
50.172 52.560 53.929
PSC
60
——XRPD
60
59.490 61.597 66.339
59.506 61.675
A
C
70
B
70
结果与分析(PSC)
几丁质酶的结构与分类
已从植物的根、茎、叶、果实以及种子中纯化得到多种 几丁质酶，并研究其结构与功能的关系。
——Collinge, D. B. et al. Plant chitinases. Plant J 1993, 3 (1), 31-40. ——Rao, D. H., Gowda L. R.. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 2175–2182.
0.00 ± 0.00
0.00 ± 0.00
0.00 ± 0.00
Ca2+会对蛋白产 生怎样的作用？
Co
Ni
59
60
0.00 ± 0.00
0.01 ± 0.00
0.00 ± 0.01
0.00 ± 0.00
Cu
Zn
63
66
0.04 ± 0.00
0.00 ± 0.00
0.03 ± 0.00
0.00 ± 0.00
一、PSC的分离纯化
结果与分析(PSC)
分离纯化结果
30 kDa
阴离子交换层析图谱
SDS-PAGE图谱 泳道M：标准蛋白 Marker 泳道1：纯化的PSC 凝胶过滤层析图谱
二、PSC性质表征
结果与分析(PSC)
分子量
——SEC
——MALDI-TOF-MS
天然PSC的分子量为29, 388 Da
溶解度得到改善
有毒副作用，易受干扰
溶解性好，不易受干扰， 具有独立吸收途径 肽钙产品，动物源资源
补Ca
稳定，溶解性好
化学合成，成本较高
天然？植物源资源？
几丁 质酶
研究背景(PSC)
（E.C. 3.2.1.14)又称壳多糖酶，广泛存在于动物、植物 及微生物中，可水解几丁质多聚体中的 β-1,4-糖苷键。
200 10
五、PSC与钙结合表征
0 10
20
19.869 22.637 23.627 26.015 27.485 21.694
20
结合方式
20
30 30
30
31.010 32.229 32.913 31.815 31.069 32.276 32.978
40
40
40 CuK
39.304 40.745 41.436 42.947 45.547
三、PSC结构表征
一级结构
——基因克隆
植物源 Chitinase！
PSC和几丁质酶有着 ~70%的序列同源性。 和其它同源蛋白质相 比，PSC含有21个酸 性氨基酸残基，数量 最多。 等电点：4.60
三、PSC结构表征
结果与分析(PSC)
二级结构
——CD光谱
12000 9000
≈
-1
[](deg. cm . dmol
亚细胞定位
淀粉体——新存在部位！
石榴种子中PSC的免疫TEM图
四、PSC吸收效果
结果与分析(PSC)
——激光共聚焦
Caco-2细胞吸收实验
细胞核染色
BSA孵育检测PSC
BSA孵育检测Ca2+
PSC孵育检测PSC
PSC孵育检测Ca2+
小结
PSC具有以下特点：
(PSC)
PSC是天然植物源含钙蛋白质，且钙与蛋白结合比例为 10 : 1，即含钙量达1.33g/kg。 热稳定性好
必需氨基酸组成均衡，且均高于FAO/WHO推荐量，是 优质的蛋白质资源。
PSC复合物不仅可以被Caco-2细胞吸收，且Ca2+也会伴 随着被吸收到细胞内部。
300 200
100
50
Ca2+没有结合在PSC的酶 活性位点Glu127上。
100 0 400 500 600 Wavelength (nm)
700
0 -20 0 20 40 60 80 100
-1 1/[S] (M )
酶学动力学参数比较 Km (M) 0.044 0.048 0.070 Vmax (μM•S-1) 0.027 0.030 0.048 Kcat (S-1) 0.0052 0.0058 0.0091 Kcat/ Km (M-1•S-1) 0.116 0.119 0.130
天然含钙几丁质酶（PSC）的纯 化及表征
赵 广 华
钙营养缺乏
• 全球健康问题
• 中国人均膳食营养素中钙摄入量不及推荐供 给量标准（RDA）的 50%
原因 ?
钙的日常摄入量不足 钙的吸收利用率低 不良生活饮食习惯
溶解性差 食品组分干扰 吸收途径单一
补钙制剂现状
含钙量高，价格低廉 水溶性差，易受干扰
结果与分析(PSC)
石榴种子营养成分
粗纤维：58.76%
粗脂肪：18.22% 粗蛋白：12.30%
总
糖：9.54%
还原糖：7.27% 矿物质元素（μg/g）：
K Mg Ca Na Fe Zn Mn Cu
10Hale Waihona Puke Baidu00 3250
3000
213
128
53.8
23
4.5
——李志西等．中国野生植物资源．1994（03）：11-14．
11.30 ± 0.10 0.87 ± 0.03
——MALDI-TOF-MS
Intensity (a.u.)
1200
100
400 800 400 800 0 0 10
10.854 14.068 15.404 14.146 19.925 22.720 21.789 23.696 26.090 27.622 10.924 15.484
A
A (278 nm)
g
Fluorescence Spectroscopy
0
-0.002
-0.006 -0.008 250 260 270 280 290 300 310
0
FU
Wavelength (nm)
-4
a
-8
-0.004
FU (Em. 335 nm)
-5
-12 -16
-0.006
-10
70
PSC三级结构 绿色棒状：酸性氨基酸 （Glu和Asp）
六、PSC与Ca2+相互作用
结果与分析(PSC)
二级结构
12000 9000
Ca2+不会引起PSC二级结构发生变化。
PSC-EDTA PSC PSC-EDTA-Ca
-1
[](deg. cm . dmol
)
6000 3000 0 -3000 -6000 -9000 190