苏云金杆菌几丁质酶新基因的筛选和全长基因的扩增

苏云金杆菌几丁质酶新基因的筛选和全长基因的扩增林毅1,关雄

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(1.华侨大学生物工程与技术系,福建泉州362011;2.福建农林大学生物农药研究中心,福建福州350002)

摘要:以煮沸冻融法制备PCR 扩增模板,利用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis ,Bt )几丁质酶基因特异引物进行15个Bt 血清变种的扩增分析,获得9个几丁质酶全长基因扩增产物。经克隆和序列测定,从Bt serovar.entomocidus H D109、Bt serovar.canadensis H D224、Bt serovar.alesti H D16和Bt serovar.toumano ffi H D201等4个菌株中分离了几丁质酶新基因。

关键词:几丁质酶基因;苏云金芽孢杆菌;筛选;血清变种

中图分类号:S482.292 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2004)03-0001-02

Screening and Full -length Amplification of N ovel Chitinase

G enes from 15Serovars of Bacillus thuringiensis

LI N Y i 1,G UAN X iong 23

(1.Departm ent o f Biotechn ology ,H uaqia o University ,Quanzh ou 362011;2.Biocide R esearch C enter ,Fujian Agriculture and F orestry University ,Fuzh ou 350002,P 1R 1C hina )

Abstract :Using boiling and thawing the thalli to prepare PCR tem plate ,the distribution of chitinase genes am ong the 15serovars of Bacillus

thuringiensis were detected by specific primers.And 4novel full -length chitinase genes were is olated from Bt serovar .entomocidus H D109,Bt serovar.canadensis H D224,Bt serovar.alesti H D16,and Bt serovar.toumano ffi H D201.K ey w ords :chitinase gene ;Bacillus thuringiensis ;screening ;serovar 收稿日期:2003-10-18;修回日期:2003-12-27基金项目:国家“863”项目(2002A A245011);福建省重大项目(2002N004,2001Z 026);福建省青年科技人才创新项目(2003J024)

作者简介:林毅(1976-),男,博士,讲师,从事资源生物及其基因工程研究,E -mail :lyhxm @ ;联系作者:关雄(1957-),男,博士,教授,从事生物农药研究,E -mail :gx @ 。

几丁质广泛存在于甲壳纲动物、软体动物、昆虫、真菌、高等植物以及海藻、动物关节、蹄、足等处,自然界每年生成的几丁质约有100亿吨,是地球上除纤维素外数量最多、除蛋白质外含氮量最高的天然有机化合物[1,2]

。近年来,随着几丁低聚

糖、几丁寡糖等抗菌作用、抗肿瘤和增强机体免疫功能研究的

深入,几丁质酶(EC31211114)作为制备几丁质低聚糖的重要工

具而受到相当的关注[2]。同时,几丁质酶在作物病虫害防治

方面的作用也陆续见诸报道[3]。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis ,Bt )是一种重要的

环境微生物,广泛应用于农业和卫生害虫的防治,其作用因子

主要是杀虫晶体蛋白[4]。几丁质酶往往作为添加剂,以缓解

害虫对Bt 杀虫晶体蛋白的抗性[5]。近年来,苏云金芽孢杆菌

自身的几丁质酶及其编码基因受到格外重视[6-9]。

本文通过苏云金芽孢杆菌不同血清变种的几丁质酶全长

基因的扩增分析,旨在快速获得Bt 几丁质酶新基因,促进Bt

的研究和应用。

图1　苏云金芽孢杆菌全长几丁质酶基因的扩增产物

Lane M:λDNA d ouble digested by EcoR Ⅰand Hind Ⅲ;Lane 1:Bt serovar.entomocidus H D109;Lane 2:Bt serovar.pakistani H D395;Lane 3:Bt serovar.dakota H D511;Lane 4:Bt serovar.kenyae H D560;

Lane 5:Bt serovar.canadensis H D224;Lane 6:Bt serovar.alesti H D16;

Lane 7:Bt serovar.israelensis ONR60A ;Lane 8:Bt serovar.galleriae H D161

1　材料和方法1.1　菌株和载体

15个苏云金芽孢杆菌血清变种的菌株来自美国芽孢杆菌遗传保藏中心(Bacillus G enetic S tock Center ,BG SC ),分别是:Bt serovar.finitimus H D19,B t serovar.alesti H D16,Bt serovar.kur staki 2,Bt serovar.kenyae H D560,Bt serovar.galleriae H D161,Bt serovar.canadensis H D224,Bt serovar.entomocidus H D109、Bt serovar.aizawai H D11,Bt serovar.tolworthi H D537,Bt serovar.

toumano ffi H D201,Bt serovar.thompsoni H D542,Bt serovar.pak 2

istani H D395,Bt serovar.israelensis ONR60A ,Bt serovar.dakota

H D511,Bt serovar.indiana H D521。

大肠杆菌DH5

α菌株来自福建农林大学植物病毒研究所。1.2　引物根据NC BI 中收录的Bt 几丁质酶基因序列设计合成一对特异引物chi -A 和chi -B ,扩增产物为全长的几丁质酶基因,大小为2.0～2.1kb 。序列如下:

chi -A :5’-ATGG T C ATG AGG T CT C -3’chi -B :5’-CT ATTT CG CT AATG ACG-3’1.3　载体和试剂克隆载体pM D18-T (约2.7kb )购自大连宝生物。T aq DNA 聚合酶和DNA 限制性内切酶为大连宝生物产品,PCR 产物回收试剂盒Ultraclean T M 15DNA Purification K it 购自上海博亚,其它试剂均为分析纯。1.4　模板的制备采用煮沸冻融裂解法制备PCR 模板。取50μL 对数生长期Bt 菌液,离心收集菌体,加入100μL 超纯水,涡旋使菌体均

匀扩散,于沸水中煮5min ,-20℃冻3min ,沸水中再煮5min ,

-20℃再冻3min ,12000r/min 离心3min ,所得上清即可作为

PCR 模板。

1.5　PCR 扩增和分析

以制备的菌体裂解液上清为模板,在T 3Therm ocycler (Biometra R )基因扩增仪上进行PCR 扩增,反应程序为:94℃变性60s ,55～50℃退火60s (每3个循环降1℃,50℃时20个循环),72℃延伸2min 。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳,E B 染色后经凝胶成像系统成像。1.6　大肠杆菌感受态细胞的简易制备

收集对数生长期的大肠杆菌DH5

α菌体,加入预冷的0.1M CaCl 2溶液悬浮,离心20s ,加入适量预冷的0.1M CaCl 2溶液悬浮,4℃保存备用,10h 后7d 内可用。1.7　克隆和序列测定PCR 产物回收纯化后,与pM D18-T 载体连接,转化 E.coli DH5α,酶切鉴定后进行序列测定,先各测定一个反应。序列分析利用NC BI 上的BLAST 软件进行T ranslated query vs.pro 2

tein database (blastx )分析。2　结果

表1　15个苏云金芽孢杆菌血清变种的几丁质酶基因检测结果Bt serovar S train Presence of chitinase gene indiana HD521-finitimus HD19-entomocidus HD109+

pakistani HD395+kenyae HD560+tolworthi HD537-canadensis HD224+dakota HD511-aizawa HD11+

alesti HD16+thompsoni

HD542-israelensis ONR60A

+kur staki 2+toumano ffi HD201+galleriae

HD161-

对15个血清变种的苏云金芽孢杆菌菌体裂解液进行的PCR