苏云金杆菌几丁质酶新基因的筛选和全长基因的扩增

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抗稻瘟病几丁质酶产生菌的筛选及产酶条件的研究

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温度（ ℃）
图４温度对菌株产酶活力的影响
取在ＬＢ培养液中培养２ｄ的Ｈ３和Ｈ９菌株种
第２１卷第１期
２１０１年３月
湖南工程学院学报ＪｕｎｌｏｕａｎｔｔｔｆＥｎｉｅｒｎｏｒａｆＨｎｎＩｓｉｕｅｏｇｎｅｉｇ
Ｖｏ．１Ｎｏ１１２．．
Ｍａ．ｒ２Ｏｌｌ
抗稻瘟病几丁质酶产生菌的筛选及产酶条件的研究
参照中国科学院上海植物生理研究所和上海市植物生理学会主编的《代植物生理学实验指现
南》［．
１３稻瘟病病原茵细胞壁悬浮物制备及菌株筛选．
质的降解产物一几丁寡糖能诱导启动植物的防御系统，刺激植物生长发育Ｌ．丁质酶产生菌是一类能２几］够利用几丁质为碳源而生长的微生物，其共同特征
隔１２ｈ检测一次几丁质酶活力．结果如图３所示，
Ｈ３菌株从６０ｈ开始产酶活力增长加快，７到２ｈ时达到最高值．２ｈ后酶活性逐渐下降．可能是随７这着时问的延长，养液中产生大量芽孢，营养体生培成减少，导致产酶能力下降．Ｈ９菌株酶活力增长比

微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌(Bt)的研究现状及应用

微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌（Bt）的研究现状及应用作者：高成华来源：《农业工程技术·温室园艺》2015年第06期苏云金杆菌又称苏云金芽胞杆菌，简称Bt。

苏云金杆菌的发现，为人们利用微生物消灭植物病虫害提供了美好的前景。

化学杀虫剂的长期使用对生态环境产生了严重的破坏，而害虫种群的抗药性也日益提高，因此生物杀虫剂因为其“绿色环保”的特点日益引起人们的广泛关注。

现在，人们已经用发酵罐大规模地生产苏云金杆菌并制成粉剂或可湿剂、液剂，应用于农业，对100多种害虫有不同的致病和毒杀作用。

苏云金芽孢杆菌是目前世界上产量最大、应用最广的生物杀虫剂。

本文简要介绍作为生物杀虫剂的Bt的发展历史、研究现状和应用情况。

研究历史[1]1901年，日本学者石渡繁胤（Ishiwata Shigetane）从虫尸体液中分离出苏云金杆菌猝倒变种（Bacillus.thuringiensis var.sott）成为苏云金杆菌研究的起点[2]。

1911年，Berliner发现一杆菌，并详细描述了该菌的形态和培养特征，定名为苏云金杆菌（Bacil-lus.thuringiensis），指明苏云金杆菌含伴孢晶体（Paraspora crystl）[3]。

1938年，苏云金杆菌商品化，用于防治地中海粉螟。

20世纪50年代许多国家进行了商业性生产。

1953年，Hannay第一次发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关，并和Fitz-James于1955年证实，伴孢晶体是一种蛋白质。

1981年，Schnept和Whiteley首次将HD21菌株伴孢晶体的基因克隆到大肠杆菌中，并得到表达。

20世纪60年代用血清学技术进行Bt的鉴定和分类。

自二次世界大战后，苏云金芽孢杆菌被广泛使用，至今已有60多年[4]。

由于其推广力度以及人们的农药使用意识的传统观念限制，目前生物农药仅占全部农药市场份额很少一部分，从此可看出，苏云金芽孢杆菌杀虫剂任然具有较大的发展潜力。

从崖城农田土壤中发现一种具有杀死植物害虫功能的细菌——苏云金解析

从崖城农田土壤中发现一种具有杀死植物害虫功能的细菌——苏云金芽孢杆菌崖城高级中学高一（1）班龚彩秀指导老师：翟鸿武一次偶然的机会让我在一本生物杂志上接触到苏云金芽孢杆菌（Bacillus Thuringiensis ,Bt）当时的我觉得很神奇——它能杀死农作物害虫。

人类从刀耕火种以来，一直备受害虫的威胁，给人类的生活造成了多种危害，其中虫害是威胁农作物高产的主要原因之一，全世界每年因此损失约数千亿美元，每年世界上因虫害而造成的农产品损失估计为13％。

在我国，水稻每年因虫害减产10％以上，小麦减产近20％，棉花产量损失达20％～30％。

为了控制农林病虫害，人们不得不大量使用化学农药，但长期大剂量地使用化学合成的农药，致使多种害虫对化学杀虫剂产生了一定的抗性，因此不但不能有效地控制害虫，结果还面临着三大难题无法解决，①环境污染，残毒上升，人畜均遭毒害；②用药浓度不断提高，防治费用不断增加，不得不无休止地研制新农药；③杀伤天敌，破坏了生态平衡，引起害虫再猖獗和次虫害虫大爆发，导致自然界中恶性循环。

苏云金芽孢杆菌由于能在生长代谢过程中产生对多种农林害虫具有特异性杀虫毒力的生物活性蛋白，并能由此生产相应的微生物杀虫剂来用于害虫生物防治而受到国内外的广泛重视。

广泛的研究与应用实践证明，与化学农药等其他类型的杀虫剂相比，Bt杀虫剂具有杀虫特异性强，对人、畜及非目标昆虫无毒副作用；安全性能好，不污染环境，由于具有多种类型的杀虫晶体蛋白，昆虫难以产生抗性或产生抗性较缓慢；具较低的生产成本等优点。

目前已推广使用的表达Bt毒素基因的转基因植物都有较为显著的抗虫性能，在大田栽培中无需或只需喷洒少许化学杀虫剂，从而大大减少了对环境的污染。

因此苏云金芽孢杆菌作为新型生物农药解决了一个长期以来让无数劳动农民头痛的问题。

而对生物有着浓厚兴趣的我对它有种相识恨晚的感觉，而这次的“科技创新”活动让我坚定了对它认识的决心，在老师和同学们的帮助下，我开始了我的创新实验。

从土壤里筛选产纤维素酶细菌的步骤

从土壤中分离产几丁质酶的真菌作者：王春学号:11101680摘要：几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株.1 材料与方法1.1 培养基1.1.1 平板培养基 (1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.(2)纯几丁质培养基:胶体几丁质 5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2 摇瓶培养基 (1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂1.2 菌株的分离1.2.1 菌株初步分离从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h.1.2.2 菌种的二次筛选从第1次稀释涂布的平板中挑取可以产生透明圈的菌落,再一次通过稀释涂布的方法,将其接种于纯几丁质平板和细菌几丁质平板上,培养72h,以取得纯菌落平板.从第2次筛选的纯菌平板上选取水解圈直径与菌落直径比最大的菌种,将其接种于50mL的LB种子培养基上,12h后以2%的接种量接于100mL的细菌几丁质发酵培养基中,在30℃下进行扩大培养.1.3 菌种的鉴定1.3.1 细菌染色体DNA提取从新培养产几个质酶活性高的革兰氏阴性细菌平板上,挑取一环菌落至加有500μLTE缓冲液的1.5mL微量离心管中,混匀后沸水浴1.5min,迅速低温离心(12000r・min-1)10min,取上层清液分装后,置4℃下保存备用.1.3.2 16SrDNA引物根据16SrDNA的结构,应用B2/B3做引物,该引物扩增片段包含V8和V9两个高变区,扩增产物大小为1050bp(basepair,碱基对)左右.这两个引物序列为B2:5’2ACGGGCGGTGTGTAC23’;B3:5’2CCTACGGGAGGCAGCAG23’.1.3.3 聚合酶链反应(PCR)检测 PCR反应体系为20μL,二次蒸馏水12.6μL,10倍扩增缓冲液2.0μL,25mmol・L-1Mg2+1.6μL,各2.5mmol・L-1的脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.4μL,20μmol・L-1引物各1.0μL,DNA模板1.0μL,5GU・L-1Taq酶0.4μL.PCR循环:94℃预变性5min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸90s,循环30次,并在72℃后延伸15min.1.3.4 扩增产物的电泳分析用1倍的TAE缓冲液配制质量分数为1%琼脂糖凝胶.取PCR 扩增产物10μL,加2μL溴酚蓝指示剂,混匀后加样,于100V下电泳1.5h,紫外灯下观察电泳结果.1.3.5 序列测定与分析将观察到的PCR产物切胶,用胶回收试剂盒回收后,连接到pMD182T上,送北京奥科生物公司进行测序.然后,将测序结果通过GeneBank进行BLAST序列比对,得出结果参考文献[1] BROGLIEKE.Chitinaseandplantprotection[J].RevPlantPathol,1993,2:4112421.[2] 李力,黄胜元,关雄.产几丁质酶的苏云金杆菌菌株筛选及酶合成条件研究[J].中国病毒学,2000,15(51):94297.[3] CHANGYu2cheng,YANGChiyea,LIChin,etal.IdentificationofBacillussp,Escherichiacoli,Salmonellasp,StaphylococcusspandVibriospwith16SribosomalDNA2basedoligonucleotidearrayhybridization[J].Internation2 alJournalofFoodMicrobiology,2006,107:1312137.[4] 张龙翔,张庭芳,李令媛.生化实验技术[M].北京:高教出版社,1997:1112116.[5] MOOREER,KRUGERAS,HAUBENL,etal.16SrRNAgenesequenceanalysesandinter2andintragenericre2lationshipsofXanthomonasspeciesandStenotrophomonasmaltophilia[J].FEMSMicrobiolLett,1997,151(2):1452 153.[6] MIYAJIT,OTTAY,SHIBATAT,etal.PurificationandcharacterizationofextracellularalkalineserineproteasefromStenotrophomonasmaltophiliastrainS21[J].LettApplMicrobiol,2005,41(3):2532257.[7] MADHA VAPNK,BAIJUTV,SANDHYAC,etal.ProcessoptimizationforantifungalchitinaseproductionbyTrichodermaharzianum[J].ProcessBiochem,2004,39:158321590.[8] NAWANINN,KAPADNISBP.Optimizationofchitinaseproductionusingstatisticsbasedexperimentaldesigns[J].ProcessBiochem,2005,40:6512660。

苏云金杆菌cry1aa基因的表达和定点突变

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嗜热真菌热稳定几丁质酶基因的克隆、表达与分子改造

嗜热真菌热稳定几丁质酶基因的克隆、表达与分子改造几丁质(chitin)是由N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接起来的直链多聚物,是最丰富的天然高分子化合物之一,广泛分布于动物、植物及微生物体内。

几丁质酶可以水解几丁质产生几丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖,且广泛存在于自然界的生物中。

近年来,随着几丁质酶的降解产物在医药、食品、农业、环保、造纸、化工等领域的应用越来越深入,几丁质酶作为制备几丁寡糖的重要工具越来越受到人们的重视。

国内外已筛选出多种几丁质酶生产菌,并将其分离提纯。

但是,直接由真菌发酵产生几丁质酶在工业化生产中受多方面因素的限制,随着分子生物学技术的发展,人们已不满足于从原始产生生物中提取和利用几丁质酶,而是希望得到编码这种酶的基因并转入宿主进行高效低成本的表达。

因此利用重组微生物实现几丁质酶的工业化生产、提高几丁质酶活性和产量,是目前较为理想的方法。

嗜热子囊菌原变种(Thermoascus aurantiacus var. aurantiacus)是一种广泛分布的,生长上限温度较高的嗜热真菌,能够在45℃～50℃的高温下很好的繁殖生长。

本研究根据真菌几丁质酶的同源保守序列设计兼并引物,通过RT-PCR 和Tail-PCR等技术首次从嗜热子囊菌原变种中分离得到了一种几丁质酶基因Chit-TAA,全长DNA为1826bp,在包含一个由1191个核苷酸构成的开放阅读框,编码396个氨基酸,该基因cDNA在GenBank中的登录号为GU338053。

序列比对分析表明,该蛋白属于糖苷水解酶18家族几丁质酶,其中两个序列S-GGW和DG-D-DWE非常保守。

这两段保守氨基酸序列与糖基水解酶(glycosylhydrolases)18家族催化活性有关。

其中不变氨基酸残基Asp和Glu为几丁质酶的催化活性位点。

利用基因重组的方法构建酵母分泌型表达载体,并转化到毕赤酵母中。

于MD/MM平板上筛选His+Mut+表型的酵母转化子,经过PCR检测及G418抗性筛选得到多拷贝整合子,进行甲醇诱导培养。

微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌(Bt)的研究现状及应用

《微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌（Bt）的研究现状及应用》苏云金杆菌又称苏云金芽胞杆菌，简称Bt。

苏云金杆菌的发现，为人们利用微生物消灭植物病虫害提供了美好的前景。

现在，人们已经用发酵罐大规模地生产苏云金杆菌并制成粉剂或可湿剂、液剂，应用于农业，对100多种害虫有不同的致病和毒杀作用。

苏云金芽孢杆菌是目前世界上产量最大、应用最广的生物杀虫剂。

本文简要介绍作为生物杀虫剂的Bt的发展历史、研究现状和应用情况。

1938年，苏云金杆菌商品化，用于防治地中海粉螟。

20世纪50年代许多国家进行了商业性生产。

1953年，Hannay第一次发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关，并和Fitz-James于1955年证实，伴孢晶体是一种蛋白质。

1981年，Schnept和Whiteley首次将HD21菌株伴孢晶体的基因克隆到大肠杆菌中，并得到表达。

20世纪60年代用血清学技术进行Bt的鉴定和分类。

自二次世界大战后，苏云金芽孢杆菌被广泛使用，至今已有60多年[4]。

简介Bt是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，为昆虫病原细菌，其菌体为短杆状、有鞭毛，一般单生或形成短链。

苏云金芽孢杆菌生物杀虫剂概述

苏云金芽孢杆菌生物杀虫剂概述[摘要]苏云金杆菌是一种在自然界中广泛分布的好气芽孢杆菌，它能产生特异性的杀虫结晶蛋白, 对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、螨类和线虫等许多有害的昆虫有毒杀作用。

[关键词]苏云金芽孢杆菌历史杀虫机理苏云金杆菌(Bacillus.thuringiensis.简称Bt)从自然界分离出来的昆虫病原细菌，革兰氏染色阳性，在芽孢形成期间能产生伴胞晶体。

它是一类发展时间最早的生物杀虫剂，在害虫的综合防治中已经成为一种占主导地位的生物农药。

自商品化以来，Bt 产品就以其高效安全、对目标害虫的特异性、生物降解无残毒等优点而倍受亲睐，并逐渐成为研究最深入、应用最广泛的生物杀虫剂。

然而Bt 目前仍然不能完全替代化学农药，因为它在具有绿色、环保等优势的同时也具有一些重大缺陷，主要是产品的稳定性较差、残效期短、杀虫速度慢等，另外货架寿命短也是限制其发展的重要因素。

为此人们不断地对它进行改造。

一、苏云金芽孢杆菌的研究历史1901年，日本学者石渡繁胤(S.Ishiwata)从虫尸体液中分离出一所谓的猝倒细菌(Sott bacteria)。

按现在的分类系统，该菌就是现在苏云金杆菌猝倒变种(Bacillus.thuringiensis var.sott)。

石渡繁胤的发现，成为苏云金杆菌研究的起点[6]。

1911年，Berliner分离出一种杆菌，他详细描述了该菌的形态和培养特征，并定名为苏云金杆菌(Bacillus.thuringiensis)。

他指明苏云金杆菌含伴孢晶体(Paraspora crystl)，但不曾说明伴孢晶体有杀虫的作用。

Berliner所定名的苏云金杆菌按现在的分类系统，应该是苏云金杆菌苏云金变种(Bacillus thuringiensis var. thuringiensis)。

1938年，第一个苏云金杆菌商品制剂Sporeine，在法国问世，并用于防治地中海粉螟。

1953年，Hannay第一次发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关。

苏云金芽孢杆菌

本文对农业上研究最多、用量最大的两类微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）和昆虫杆状病毒（baculovirus）进行了综述，分别论述了它们的杀虫优势、杀虫的分子机理、目前的研究状况，并对它们的基因工程技术改良路线以及在农业上的应用，提出了一些建议。

由病虫害引起的农作物的减产减收已成为制约农业生产进一步发展的限制因素，全球每年农作物因虫害造成的损失约占总产量的13％，而目前对农作物害虫的防治主要依赖于化学农药。

完全依赖化学杀虫剂存在许多弊端，其中最主要的问题是，一种化学物质的广泛使用会使害虫的后代产生选择性进化优势，从而对该化学物质产生抗性。

例如，世界各地的家蝇品系对杀灭它们的每种杀虫剂都产生了抗性。

第二个问题是，有的杀虫剂影响非靶目标品种，产生灾难性后果，某些益虫被无意中消灭，导致其次要害虫急剧增长。

第三问题是在于环境的耐受性和许多杀虫剂的毒性，不仅造成了严重的环境污染，而且给人类的健康带来巨大的威胁。

上述不利因素促使人们急欲寻求控制害虫的替代方案。

在对农业害虫进行的长期防治实践中，人们逐渐认识到必须采取综合治理的措施，才能有效的控制害虫的危害。

基因工程技术的发展，为防治农林害虫提供了一种有效、减污的新技术手段，微生物农药也因此在世界范围内受到广泛重视。

微生物农药是指非化学合成、具有杀虫防病作用的微生物制剂，如微生物杀虫剂、杀菌剂、农用抗生素，等等。

这一类微生物包括杀虫防病的细菌、真菌和病毒。

杀虫微生物是指其代谢产物或微生物本身对宿主昆虫有致死效应或致病的微生物类群，通常也称为昆虫病原微生物。

目前已知的杀虫防病微生物主要有芽孢杆菌科、假单胞菌科、肠杆菌科、链球菌科和杆状病毒科等类群。

尽管不同杀虫微生物引起昆虫致病的症状不尽相同，但杀虫微生物对害虫的作用方式主要是通过产生特异性的杀虫毒素来破坏害虫的代谢平衡，或者是通过营养体在虫体内的繁殖复制而引起昆虫死亡和发生流行病。

苏云金杆菌增效细菌研究进展

苏云金杆菌增效细菌研究进展杨庆仙(河北政法职业学院园林系,河北石家庄050061) 摘　要:苏云金芽孢杆菌Bt制剂是当前应用最广、最有效的一种细菌杀虫剂,因其对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、同翅目等昆虫以及动植物线虫、蜱螨等节肢动物都显示杀虫活性而倍受人们关注。

综述对苏云金杆菌具有增效作用的细菌的研究进展。

目前,环境微生物中Bt增效细菌主要有苏云金杆菌、蜡状芽孢杆菌,其发酵上清液或芽孢不同程度地提高了苏云金杆菌防治害虫的效果。

关键词:苏云金杆菌;增效;细菌;研究进展中图分类号:S482.2+92　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2008)01-0055-04 苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是目前产量最大、使用最广的生物杀虫剂。

它的主要活性成分是一种或数种杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal pro2 teins,ICPs),又称δ2内毒素[1],对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、同翅目等昆虫,以及动植物线虫、蜱螨等节肢动物都有特异性的毒杀活性,而对非目标生物安全,因此,Bt杀虫剂具有专一、高效和对人畜安全等优点。

目前苏云金杆菌商品制剂已达100多种,是世界上应用最为广泛、用量最大、效果最好的微生物杀虫剂,因而倍受人们关注。

但是,商品Bt制剂在生产防治中也显示出某些局限性,如速效性差、对高龄幼虫不敏感、田间迟效期短以及重组工程菌株遗传性状不稳定等都已成为作者简介:杨庆仙(19672),女,河北安新人,副教授,主要从事病虫害防治教学工作。

收稿日期:2007-07-05影响Bt进一步成功推广使用的制约因素。

因此,为了提高Bt制剂的杀虫效果,对其增效途径的研究已成为世界性的研究热点,主要包括:筛选增效菌株[2];利用化学添加剂[328]、植物它感素[9212]、几丁质酶[13]作为增效物质;昆虫病原微生物间的互作增效[14218]等。

苏云金芽孢杆菌的分离与鉴定

聚昔探针也应用于Ｃ基因鉴如光核酸设计被ｒ的定。刘旭等ｙ
总ＤＡ检ｃ基因Ｎ中测ｒｙ类型的方法，测结果具有很高的检可
映基因组中存在的功能基因，鉴定方法是适应基因组时代的
Ｃｔ名ｒａ志ｔ定的究人了子代１１５建立了一种不经ＰＲ扩增而直接应用寡聚核昔酸芯片从Ｂ为ｃＩ，着Ｂ鉴研进分时［０ｙ标Ａ６９１９可大规模、高通量、真实地反出了新的Ｃ基因ｒｙ命名原则，ｃ基因的使得ｒｙ分类趋于完善。信度。应用寡聚核昔酸做探针，
晶体蛋白已成为应用最成功、前景最好的生防农药。苏云金芽抱杆菌广泛分布于昆虫、土壤、仓贮尘埃、污水之中。基于
１弹土分离法该方法简便，．３易操作。将土壤样品干燥后研碎，撒在灭菌的滤纸上，使滤纸面上均匀粘上一层样品
粉末，使粘有样品的一面对着培养皿口，１２然后轻弹一次，
摘要苏云袍杆菌ＢｃｕｄｉｉＢ自１１被日者发现以来，于金芽（ａｌｕｎｓ９年ｉｓ如ｍ，０ｌｗｔ）本学由在生物防治中突出的作用，世界各国极大关受到的注。作为基研究，的与在发现新型ｃ蛋白与础性Ｂ分离鉴定ｔｒ基因应用方面ｙ起着举足轻重的作用。对Ｂ的从最被感染宿各国ｔ研究初的
ＢｃｓｏｉｉｏａｃｉａｉｌｒｔｃｓｆａｏａｉｎｆａｏｏＢａｃｇｅｅｏａｔｈｉｅｉｔｎｉｒｔｏＢｒｅｕｆｍｒｎｎｃｔ，ｌｓｃｉｎｄｔｃｉｆｎｒｅｗｒｉｐｔｆｔｎｓａｏｏｄｅｉｔａｅｔｐｔｅｇｕｕｈａｉｔｎｅｉｔｓｒｅｅｉｄｉｎｔｙｅｍｒｎｏｅｔｉｆｓｆ－ｄｎｒｖｇｖｙｅ。，ｈｓｅｏｎＢｓａｗｈｏｎｅｉｅｉｄｌｉａｔｃｎｏｎｃｇｅｉｉ．ｈｒｉ，ｃｓｆａｏｏｔｃｎｅｔｎｈｈｏｌｃｃａａｉｔｈｌｅｅｒｅｐｄｔｇＩｔｓｅｔｌｓｉｔｎｅｆｅｒｗｔｉｉｉｒｎｔｉｃｖｎｅｆｙｒｃｎｎｅｗｈａｉｉｆｒｔｇｖｓｔｙｄｏｗｎｅｉｖｅｃＢｓｉａｃｇｅａｔｉｎｆｔｎｈｏｃｇｅｗｒｄｃｓ．ｔｎｎｒｅｓｎｈｄｔｃｉｍｔｄｒｅｓｕｅｔｓｙ，ｅｉａｏｅｏｆｎｅｉｓｄｒａｄｎｄｅｉｙｅｓ

高三现代生物科技专题综合测试题

高三现代生物科技专题综合测试题专题一1.利用基因工程生产蛋白质药物，经历了三个发展阶段。

第一阶段，将人的基因转入细菌细胞；第二阶段，将人的基因转入小鼠等动物的细胞。

前两个阶段都是进行细胞培养，提取药物。

第三阶段，将人的基因转入活的动物体，饲养这些动物，从乳汁或尿液中提取药物。

（1）将人的基因转入异种生物的细胞或个体内，能够产生药物蛋白的原理是基因能控制。

（2）人的基因能和异种生物的基因拼接在一起，是因为它们的分子都具有双螺旋结构，都是由四种构成，基因中碱基配对的规律都是。

（3）人的基因在异种生物细胞中表达成蛋白质时，需要经过和翻译两个步骤。

在翻译中需要的模板是，原料是，直接能源是，搬运工兼装配工是，将氨基酸通过肽键连接成蛋白质的场所是，“翻译”可理解为将由个“字母”组成的核酸“语言”翻译成由个“字母”组成的蛋白质“语言”，从整体来看在翻译中充任着“译员”。

2、如下图所示，在a 、b 试管内加入的DNA 都含有30对碱基，四个试管内都有产物生成。

请回答：abc d（1）a 、d 两试管内的产物是相同的，但a 试管内模拟的是过程；d 试管内模拟的是过程。

（2）b 、c 两试管内的产物都是，但b 试管内模拟的是过程；c 试管内模拟的是过程；b 试管的产物中1个分子中最多含有碱基，有个密码子。

(3)d 试管中与a 试管相比，特有的酶是。

3、（2003年上海高考题）艾滋病病毒（HIV ）是一种球形的RNA 病毒，HIV 侵染T 淋巴细胞并繁殖新一代病毒的过程示意图如下。

请回答：DNAATP酶脱氧核苷酸 RNA ATP 酶核糖核苷酸 DNA ATP 酶核糖核苷酸RNA ATP 酶脱氧核苷酸（1）图中①表示病毒正侵染淋巴细胞。

进入寄主细胞的是病毒的_________。

（2）遗传学上将过程②称为_________。

（3）③和④的信息传递过程分别称为____________________________。

苏云金芽孢杆菌简介

苏云金芽孢杆菌简介组员：张晓云李文慧2010年5月10日明治维新后，日本成为当时最大的蚕丝产地和最主要的蚕丝出产国猝倒病病蚕停止进食桑叶，随后出现颤抖的症状，并且很石渡繁胤（いしわたしげたね）(1868-1941)猝倒杆菌恩斯特·贝尔林纳（ErnstBerliner）在德国苏云金省重新分离得到正式定名为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,B.t.)Mattes在1927年重新从地中海粉螟中分离出了Bt 能杀死鳞翅目昆虫，对其它动物却没有什么影响Bacillus thuringiensis))苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis革兰氏阳性土壤杆菌芽孢杆菌属菌体短杆状，生鞭毛，单生或形成短链20世纪20年代末，美国用于控制舞毒蛾法国在1938年成功地研制出第一个商业化的Bt杀虫剂Sporine。

20世纪50年代，Bt作为绿色有机农药，取代DDT在美国开始被大规模地应用Bt 的没落和新生•不需要人工喷洒•新作物不确定性大大降低•误伤非农业害虫的几率变低•尚未发现对人类健康有任何负面影响•对环境贡献巨大新特点•价格昂贵•须多次喷洒•化学合成杀虫剂出现旧缺点转基因技术抗虫蛋白基因转入基因转入玉米、棉花基因克隆cry 基因蛋白提纯cry 蛋白-内毒素伴胞晶体蛋白发现δ-内毒素伴胞晶体蛋白虫吃了会死，人吃也有害？Bt安全性毒性检测毒理研究免疫学•老鼠：3.8-5g/kg体重•我国≤2.5微克/g•60kg的人吃120吨稻米•原毒素•受酶激活，作用于肠道受体造成穿孔•人体不存在激活蛋白酶•结构与已知过敏原相差很大•没有能引起过敏反应的实验依据•争议案例缺乏说服力Bt对环境的影响节肢动物群落特征参数特征参数MH—BT MH-bt田水MH—常规SY-Bt SY-bt田水SY—常规物种 535153525152 SIMPSON(J) 0.888180.890810.893020.890950.88910.89395 SHANNON(H) 3.90161 3.92576 3.94629 3.95656 3.92669 3.97552均匀度 0.681160.692080.688960.694080.692240.69741新型抗虫蛋白鞘翅目昆虫（天牛）双翅目昆虫（黑蝇）河盲症（RiverBlindness），仅次于沙眼之后的第二大致盲传染病蟠尾丝虫症控制计划（OCP），3000万人得到保护，直接避免盲眼的人数26.5万人基因组测序概况2 complete，2 assembly，14in progressB. thuringiensis 97-27，B.thuringiensis Al Hakam，均无杀虫活性苏云金芽孢杆菌YBT-1520，华中农业大学，含有cry1A a、cry1A b、cry1A c、cry2A a和cry2A b，但拼接困难内生质粒，在细胞内呈共价闭合环状的形式(cccDNA)，已有22 个质粒完成了全序列测定Bt 97-27 的染色体圈图注: 最外面两圈表示基因的起始位点和指定的功能分类;第1 圈包括正链基因产物;第2 圈包括负链基因产物;第3 圈和第4 圈表示特有基因;第5 圈和第6 圈表示原噬菌体基因;第7 圈表示插入序列元件;第8 圈表示(G+C)含量;第9 圈表示GC 偏好性(卡其色表示值>1, 紫色表示值<1)颜色代表功能分类如下: 浅蓝色—氨基酸的生物合成; 浅肉色—辅助因子的生物合成; 暗肉色—细胞膜; 橙色—细胞加工; 橙红—重要中间代谢; 绿色—能量代谢; 黑色—脂肪酸和磷脂代谢; 青色—其他分类; 暗灰色—蛋白凋亡; 黄色—嘌呤、嘧啶、核苷和核苷酸; 浅绿色—调控功能; 蓝色—复制;浅灰色—转录和翻译; 洋红色—转运和结合蛋白; 褐色—未指定的编码; 红色—未知功能pBtoxis 质粒圈图注: 外边两圈表示正反链上预测的基因, 外圈刻度标尺的单位为kb; 最里面一圈表示GC 偏好性, 黄褐色表示值>1, 紫色表示值<1; 第2 圈表示（G+C）含量基因由不同的颜色来代表如下: 灰色—毒素和肽类抗生素; 粉红色—转座子相关; 橙色—保守假定的;红色—DNA 代谢; 蓝色—调控; 鲜绿色—表面关联的; 灰绿色—未知; 黄色—各种代谢因子谢谢！References/archives/37319.html谭寿湖等. 苏云金芽孢杆菌基因组研究概况[J].基因组学与应用生物学, 2009, 28(1),202-208图片来源于参考文献及网络图片。

Bt及转基因作物

苏云金杆菌和转Bt基因作物苏云金杆菌是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，在形成芽孢的过程中产生伴孢晶体。

1901年日本学者石渡繁胤首次报道引起家蚕“猝倒病”，此为苏云金杆菌研究的起点。

1911年，Berliner在《粮业杂志》上报道了从德国苏云金省面粉厂寄出的一批地中海粉螟Anagastra kühniella(Zeller)中分离到一种杆菌，1915年将该菌定名为苏云金杆菌。

苏云金杆菌在自然界中分布广泛，从昆虫、土壤、贮藏品及尘埃、污水、植被等来源上都有分布。

目前已分离到上万个Bt菌种，分别属于34个血清型，50多个亚种。

众所周知，苏云金杆菌是一种常用的生物杀虫剂，对某些鳞翅目昆虫有毒杀作用。

敏感昆虫取食伴孢晶体后，在幼虫中肠高pH值条件下溶解成原毒素，并被蛋白酶水解成活化毒素，活化毒素的分子量为50～70kDa（Höf ter等,1989）,与敏感昆虫中肠上皮细胞膜上的受体结合，引起细胞膜穿孔，干扰渗透平衡，生化代谢及生理功能失调，细胞肿胀及裂解，幼虫停止取食，最终死亡（Knowles，1994）。

Hannay等（1953）首次研究发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关，并证明晶体是可在碱性条件下溶解的杀虫晶体蛋白。

近年来，随着人们对环境问题的日益重视和对昆虫抗药性的关注，苏云金杆菌作为一种对人类和有益生物安全、不污染环境的微生物杀虫剂得到广泛应用。

1938年苏云金杆菌首次在法国登记。

1957年美国太平洋酵母公司生产出第一个商品制剂——Thuricide(罗余平，1994)。

我国80年代以来，苏云金杆菌商品化稳定发展，成为主要的微生物杀虫农药。

1981年，Schnepf和Whiteley首次将Bt晶体蛋白基因克隆到大肠杆菌E．coli中，发现表达后的晶体蛋白对烟草天蛾Manduca sexta幼虫具有很高的毒杀作用。

继1983年世界上第一例转基因植物问世后，1987年Vaeck等首先报道了用3’- 端缺失的Cry1Ab基因与卡那霉素抗性基因（NPTⅡ）融合后通过Ti质粒系统转入烟草，获得了对烟草天蛾Manduca sexta 的抗虫性。

高中生物选修基因工程药物及基因治疗

二、动物基因工程前景广阔
特点：发展较迟，应用方面广
1、提高生长速度（
）
2、改善畜产品的品质（Fra bibliotek）3、生产药物
（
乳腺蛋白基因的
启动子
显微注射受精卵）
4、作为器官移植的供体
（
某种调节因子，以
，或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，
培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。）
三、基因工程药品异军突起
干扰素是抗病毒的特效药，从人血中提取干扰素，300L血才提取1mg！
人
通过基因工程的方式创造了能合成人干扰素的大肠杆菌及酵母菌，每1Kg的培养液可提取 20—40mg干扰素
造血液及其生
产
四、基因治疗曙光初照
1、基因治疗概念：
把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，是治疗遗传病的最有效的手段。
（3）降低生产成本，减少生产人员和管理人员。
基因工程药品 —— 胰岛素（第一种基因工程药物）
胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。
将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！使其价格降低!
基因工程药品 —— 干扰素（糖蛋白、淋巴因子）
从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱；从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。
通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息
基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。
杂交测序技术

苏云金杆菌

苏云金杆菌苏云金杆菌苏云金杆菌又称苏云金芽胞杆菌，英文名称：Bacillus thuringiensis（B.t.）为了方便都将B.T.写成BT或Bt，故Bt即苏云金杆菌的简称。

苏云金杆菌杀虫剂是利用苏云金杆菌杀虫菌经发酵培养生产的一种微生物制剂。

苏云金杆菌在自然状态下以一种生物细菌的形式生存于土壤及水中。

这种杀虫菌在生长发育过程中产生芽胞并形成一种蛋白质毒素，在显微镜下观察，通常是不规则的菱形结晶，叫做伴孢晶体。

当害虫蚕食了伴孢晶体和芽孢之后，在害虫的肠内碱性环境中，伴孢晶体溶解，释放出对鳞翅目幼虫有较强毒杀作用的毒素。

这种毒素使幼虫的中肠麻痹，呈现中毒症状，食欲减退，对接触刺激反应失灵，厌食，呕吐，腹泻，行动退缓，身体萎缩或卷曲。

一般对作物不再造成危害，经一段发病过程，害虫肠壁破损，毒素进入血液，引起败血症，同时芽孢在消化道内迅速繁殖，加速了害虫的死亡。

死亡幼虫身体瘫软，呈黑色。

所以，害虫只有把Bt细菌吃到肚子里，再经过一个发病过程，才能死掉，大约48小时方能达到杀灭害虫的目的。

Bt杀虫剂与化学农药相比有许多优点第一，对人畜无毒，使用安全。

Bt细菌的蛋白质毒素在人和家畜、家禽的胃肠中不起作用。

第二，选择性强，不伤害天敌。

Bt细菌只特异性地感染一定种类的昆虫，对天敌起到保护作用。

第三，不污染环境，不影响土壤微生物的活动，是一种干净的农药。

第四，连续使用，会形成害虫的疫病流行区，造成害虫病原苗的广泛传播，达到自然控制虫口密度的目的。

第五，没有残毒，生产的产品可安全食用，同时，也不改变蔬菜和果实的色泽和风味。

第六，不易产生抗药性，这只是相对而言。

最近已经发现了抗药性的报道，但不象化学农药产生的那么快。

毒性：鼠经口按2*10^22活芽孢/Kg体重给药无死亡，也无中毒症状。

18名志愿者每人每天吞服30亿芽孢，连服5天，1个月后检查，一切化验正常，无毒性反应。

亚急性和毒性试验未见异常，对猪、禽、鸟、鱼、蜂的急性和慢性饲喂养试验未见不正常现象，对家蚕敏感。