昆虫杆状病毒及其杀虫剂的研究
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昆虫杆状病毒及其杀虫剂的研究
Insect Baculovirus
FangYang
花生苜蓿银纹夜蛾
萝卜银纹夜蛾
棉花银纹夜蛾
菠菜银纹夜蛾
大豆银纹夜蛾
昆虫是地球上最庞大的生物类群，被命名 发现的有100万种，可能有1000万种
迄今发现有1600多种昆虫能被病毒感染
已经报道的昆虫病毒超过1300多种
已经被测基因组全序列的昆虫杆状病毒有36种
信息示踪的白蚁防治
引诱白蚁的人工 示踪信息素
+
灭杀白蚁的微生 物真菌
• 武大绿洲 杨康为菜青虫颗粒体病毒和苏云金杆菌复配 秀田蛾克为AcMNPV和苏云金杆菌复配 茶园为茶尺蠖核型多角体病毒、苏云金杆菌和病 毒增效因子复配 菜园为甜菜夜蛾核型多角体病毒和高效氯氰菊酯 复配 来瘟死为甜菜夜蛾多角体病毒和苏云金杆菌复配 美林为松毛虫质型多角体病毒和苏云金杆菌复配, • 安徽绩溪奥绿公司的攻蛾为AcMNPV和甲氨阿维 复配, 茶喜为油桐尺蠖核型多角体病毒和苏云金杆菌复 配 • 天罡公司小菜蛾病毒生物杀虫剂
改进途经：
1.制剂选择（悬浮 剂、可湿性粉剂 、水分散粒剂） 2.复配（BT，昆虫 信息素，氟啶脲 ，甲氨阿维， ） 3.防紫外（光增白 剂） 4.施药时间
高效氯氰菊酯
应用举例
• 新型生物灭蟑饵剂（武大绿洲“毒力岛” ）是一种新概念的控制城市卫生害虫蟑螂 的高新技术产品。已经获得国家颁发 的三 证产品，已批量上市。 • 特点；结合了蟑螂引诱信息素和蟑螂病毒
杆状病毒杀虫剂前景分析
1. 优点
2. 限制因素 3. 工程杆状病毒的杀虫剂研究战略 4. 杆状病毒杀虫剂的剂型加工和应用
优点
杆状病毒之所以备受关注，主要原因有以下 几点： 1. 毒力高，能在自然环境中形成流行病， 具有持久控制虫害的能力； 2. 宿主的专一性，不会造成生态失衡，能 获得较大的生态效益； 3. 可造性好，特别是随着EBVs的研究深入 ，重组病毒杀虫剂的研发前景光明。
其它相关报道
• 昆虫杆状病毒用于有机茶的生防
• 昆虫杆状病毒通过寄生蜂进行生物防治 • 昆虫杆状病毒与光增白剂的复配
杆状病毒杀虫剂应用举例
• 巴西黎豆夜蛾NPV,在大豆上应用近100万 hm2
• 我国已从茶树害虫中分离出 81 种病毒，包 括 45 种核型多角体病毒NPV ，24 种GV, 其中茶尺蠖NPV、茶毛虫 NPV、油桐尺蠖 NPV、茶小卷叶蛾 GV等研究较深入。但目 前在茶叶生产上推广应用的病毒种类主要 为茶尺蠖 NPV，其次为茶毛虫 NPV 和茶刺 蛾 NPV。
限制因素
1. 2. 3. 4. 5. 6. 杀虫剂的毒性 杀虫谱 杀虫剂的生产 产品的稳定性 杀虫剂的持续性 注册和专利
工程杆状病毒杀虫剂研究战略
1. 整合昆虫自身存在和产生的激素和酶的基 因 2. 插入外源毒素基因
3. 基因组内非必需基因的重组和修饰 4. 杆状病毒宿主域的遗传改造
整合昆虫自身存在和产生的激素和 酶的基因
BEVS优势特性
1. 具有完整的感染性。（多角体蛋白基因和P10基因是
病毒复制非必须基因）
2. 时序性（多角体蛋白基因和P10基因是极晚期基因） 3. 克隆容量大，适于多个基因的同步表达 4. 表达水平高（多角体蛋白基因和P10基因启动子非常
强大）
5. 多角体蛋白基因可作为重组病毒的筛选标记 6. 安全（杆状病毒载体只能以昆虫细胞作受体系统） 7. 既可进行大规模细胞悬浮培养，又可用虫体表 达
杆状病毒杀虫剂
• 1973年FAO和WHO认可并推荐杆状病毒杀虫剂 用于大田 • 1975年美国首次登记注册HearNPV杀虫剂 • 美国仅在2011年登记的杆状病毒杀虫剂产品6个 （EPA） • 1993年，由中国科学院武汉病毒所同湖北蒋湖农 场登记了我国第一个昆虫病毒杀虫剂产品—棉铃 虫核型多角体病毒杀虫剂 • 目前，我国正式登记的NPV杀虫剂有效成分10种 ，产品38个（中国农药信息网）
• 除上述基因外,植物蛋白酶抑制剂基因和植 物细胞质雄性不育基因也被成功到转入杆 状病毒中并获得表达。 Korth等将玉米细胞质雄性不育URF13蛋白基 因转入AcNPV基因组中,表达URF13的重组 病毒在杀虫时间上与表达昆虫神经毒素的 重组病毒相当,对粉纹夜蛾幼虫的杀虫速度 提高40%,被认为是具有应用前景的重组病 毒杀虫剂 季平等将慈姑蛋白酶抑制剂B基因插入 BmNPV基因组中,重组病毒对家蚕幼虫的致 死中时间(LT50)减少10h。
对人畜绝对安全
昆虫杆 状病毒 的生活 史
杆状病毒表达载体（BEV）
• 1981年美国学者Miller从理论上阐述了杆状病毒作为运载 体系统的表达外源基因的可行性及其特点 • 1983年，Smith等人首次进行了成功实验，利用AcNPV作 载体在Sf中表达了人体β-干扰素基因，从而完成了从理论 到实践，开辟了基因工程研究新领域。 • 随后 Maeda 等用 BmNPV为载体, 在家蚕幼虫体内高水平 的表达了人的 α-干扰素。 • 目前，BEVS已得到了广泛应用,被公认为当今基因工程四 大表达系统之一( 另 3 种是细菌、酵母、哺乳动物细胞表 达系统)
Bac-to-Bac系统重组病毒的构建和基因的表达
BEVs主要流程
杆状病毒作为转移载体 基因治疗
• 基因治疗是指将正常基因或有治疗作用的 基因通过一定方式导入生物体靶细胞, 纠正 基因缺陷或者发挥治疗作用的生物医学新 技术。
• 最新的研究表明杆状病毒虽然不能感染哺 乳动物, 但可以进入不同物种和组织来源的 多种哺乳动物细胞, 并在合适的哺乳动物启 动子控制下表达外源基因。
在杆状病毒基因序列内插入调控昆虫生理及发育 的激素或酶的基因,以杆状病毒作为外源基因载体, 在宿主昆虫体内过量表达这些激素和酶,从而干扰 昆虫正常的生理反应,以达到使昆虫减少或停止取 食和加速其死亡的目的。
利尿激素(diuretic hormone,DH) 保幼激素酯酶(juvenile hormone esterase,JHE) 促前胸腺激素(prothoracotropic hormone,PTTH) 蜕皮激素(moulting hormone,MH) 羽化激素(eclosion hormone,EH) 几丁质酶(chitinase) 反义RNA
基因组内非必需基因的重组和修饰
• 杆状病毒基因组中存在一些对病毒复制、增殖非 必需的基因,其作用仅在于有利于杆状病毒在感染 末期最大限度的增殖及释放子代病毒。通过对这 部分基因的修饰或缺失,可提高杆状病毒的杀虫效 果。 egt（蜕皮甾体尿苷二葡萄糖转移酶） • pp34 • pe (多角体套膜蛋白基因) • p10 (多功能蛋白基因，参与PE的形成) • P74
利用昆虫杆状病毒防治农业、林业、卫生害 虫是害虫防治的一个重要发展方向
昆虫杆状病毒研究活跃
• 作为外源基因的高效表达载体用于基 因工程的研究；
• 作为基因转移载体用于基因治疗； • 作为生物杀虫剂用于虫害的生物防治
昆虫杆状病毒
杆昆虫杆状病毒是一类专门寄生节肢动物的病原微生 物。 基因组大小为 80-180kb, DNA 分子呈超螺旋双链闭合环状 结构特异，侵染方式特别
插入外源毒素基因
在杆状病毒中插入对昆虫神经系统特异性外源基 因,以提高杀虫效果。
• 钳蝎(Buthus eupeus)毒素(BeIT)基因 • 阿尔及利亚蝎(Androc-tonus australis)神经毒素(AaIT)基 因 • 蝎(Leiurus quinquestriutus hebreus)的LquIT2毒素基因 • 麦杆蒲螨(Pyemotes tritic)神经毒素(TxP-1)基因 • 蜘蛛(Angelenopsis aperat)毒素(u-Aga-IV)基因 • 海葵(Stomphia)的AsⅡ及ShⅠ神经毒素基因 • 苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)的δ-内毒素基因 • 黄蜂(Polistes metricus)毒素基因
杆状病毒宿主域的遗传改造
病毒杀虫谱窄的性质使其应用受到极大的限 制，产生诸如生产、注册、成本高、经济 效益低等一系列问题。 改造方法： 利用异源病毒之间的重组 相关特异基因的研究 反义RNA的重组病毒
杆状病毒杀虫剂的剂型加工和应用
杆状病毒作为活体生物 农药，在防治虫害时 间、吸收方式、生物 活性方面有自身的局 限性，严重影响到了 其推广和应用。除了 从杆状病毒本身改进 外，利用剂型加工进 行实用性的改善和增 效是提高其杀虫效果 的有效方法。
Insect Baculovirus
FangYang
花生苜蓿银纹夜蛾
萝卜银纹夜蛾
棉花银纹夜蛾
菠菜银纹夜蛾
大豆银纹夜蛾
昆虫是地球上最庞大的生物类群，被命名 发现的有100万种，可能有1000万种
迄今发现有1600多种昆虫能被病毒感染
已经报道的昆虫病毒超过1300多种
已经被测基因组全序列的昆虫杆状病毒有36种
信息示踪的白蚁防治
引诱白蚁的人工 示踪信息素
+
灭杀白蚁的微生 物真菌
• 武大绿洲 杨康为菜青虫颗粒体病毒和苏云金杆菌复配 秀田蛾克为AcMNPV和苏云金杆菌复配 茶园为茶尺蠖核型多角体病毒、苏云金杆菌和病 毒增效因子复配 菜园为甜菜夜蛾核型多角体病毒和高效氯氰菊酯 复配 来瘟死为甜菜夜蛾多角体病毒和苏云金杆菌复配 美林为松毛虫质型多角体病毒和苏云金杆菌复配, • 安徽绩溪奥绿公司的攻蛾为AcMNPV和甲氨阿维 复配, 茶喜为油桐尺蠖核型多角体病毒和苏云金杆菌复 配 • 天罡公司小菜蛾病毒生物杀虫剂
改进途经：
1.制剂选择（悬浮 剂、可湿性粉剂 、水分散粒剂） 2.复配（BT，昆虫 信息素，氟啶脲 ，甲氨阿维， ） 3.防紫外（光增白 剂） 4.施药时间
高效氯氰菊酯
应用举例
• 新型生物灭蟑饵剂（武大绿洲“毒力岛” ）是一种新概念的控制城市卫生害虫蟑螂 的高新技术产品。已经获得国家颁发 的三 证产品，已批量上市。 • 特点；结合了蟑螂引诱信息素和蟑螂病毒
杆状病毒杀虫剂前景分析
1. 优点
2. 限制因素 3. 工程杆状病毒的杀虫剂研究战略 4. 杆状病毒杀虫剂的剂型加工和应用
优点
杆状病毒之所以备受关注，主要原因有以下 几点： 1. 毒力高，能在自然环境中形成流行病， 具有持久控制虫害的能力； 2. 宿主的专一性，不会造成生态失衡，能 获得较大的生态效益； 3. 可造性好，特别是随着EBVs的研究深入 ，重组病毒杀虫剂的研发前景光明。
其它相关报道
• 昆虫杆状病毒用于有机茶的生防
• 昆虫杆状病毒通过寄生蜂进行生物防治 • 昆虫杆状病毒与光增白剂的复配
杆状病毒杀虫剂应用举例
• 巴西黎豆夜蛾NPV,在大豆上应用近100万 hm2
• 我国已从茶树害虫中分离出 81 种病毒，包 括 45 种核型多角体病毒NPV ，24 种GV, 其中茶尺蠖NPV、茶毛虫 NPV、油桐尺蠖 NPV、茶小卷叶蛾 GV等研究较深入。但目 前在茶叶生产上推广应用的病毒种类主要 为茶尺蠖 NPV，其次为茶毛虫 NPV 和茶刺 蛾 NPV。
限制因素
1. 2. 3. 4. 5. 6. 杀虫剂的毒性 杀虫谱 杀虫剂的生产 产品的稳定性 杀虫剂的持续性 注册和专利
工程杆状病毒杀虫剂研究战略
1. 整合昆虫自身存在和产生的激素和酶的基 因 2. 插入外源毒素基因
3. 基因组内非必需基因的重组和修饰 4. 杆状病毒宿主域的遗传改造
整合昆虫自身存在和产生的激素和 酶的基因
BEVS优势特性
1. 具有完整的感染性。（多角体蛋白基因和P10基因是
病毒复制非必须基因）
2. 时序性（多角体蛋白基因和P10基因是极晚期基因） 3. 克隆容量大，适于多个基因的同步表达 4. 表达水平高（多角体蛋白基因和P10基因启动子非常
强大）
5. 多角体蛋白基因可作为重组病毒的筛选标记 6. 安全（杆状病毒载体只能以昆虫细胞作受体系统） 7. 既可进行大规模细胞悬浮培养，又可用虫体表 达
杆状病毒杀虫剂
• 1973年FAO和WHO认可并推荐杆状病毒杀虫剂 用于大田 • 1975年美国首次登记注册HearNPV杀虫剂 • 美国仅在2011年登记的杆状病毒杀虫剂产品6个 （EPA） • 1993年，由中国科学院武汉病毒所同湖北蒋湖农 场登记了我国第一个昆虫病毒杀虫剂产品—棉铃 虫核型多角体病毒杀虫剂 • 目前，我国正式登记的NPV杀虫剂有效成分10种 ，产品38个（中国农药信息网）
• 除上述基因外,植物蛋白酶抑制剂基因和植 物细胞质雄性不育基因也被成功到转入杆 状病毒中并获得表达。 Korth等将玉米细胞质雄性不育URF13蛋白基 因转入AcNPV基因组中,表达URF13的重组 病毒在杀虫时间上与表达昆虫神经毒素的 重组病毒相当,对粉纹夜蛾幼虫的杀虫速度 提高40%,被认为是具有应用前景的重组病 毒杀虫剂 季平等将慈姑蛋白酶抑制剂B基因插入 BmNPV基因组中,重组病毒对家蚕幼虫的致 死中时间(LT50)减少10h。
对人畜绝对安全
昆虫杆 状病毒 的生活 史
杆状病毒表达载体（BEV）
• 1981年美国学者Miller从理论上阐述了杆状病毒作为运载 体系统的表达外源基因的可行性及其特点 • 1983年，Smith等人首次进行了成功实验，利用AcNPV作 载体在Sf中表达了人体β-干扰素基因，从而完成了从理论 到实践，开辟了基因工程研究新领域。 • 随后 Maeda 等用 BmNPV为载体, 在家蚕幼虫体内高水平 的表达了人的 α-干扰素。 • 目前，BEVS已得到了广泛应用,被公认为当今基因工程四 大表达系统之一( 另 3 种是细菌、酵母、哺乳动物细胞表 达系统)
Bac-to-Bac系统重组病毒的构建和基因的表达
BEVs主要流程
杆状病毒作为转移载体 基因治疗
• 基因治疗是指将正常基因或有治疗作用的 基因通过一定方式导入生物体靶细胞, 纠正 基因缺陷或者发挥治疗作用的生物医学新 技术。
• 最新的研究表明杆状病毒虽然不能感染哺 乳动物, 但可以进入不同物种和组织来源的 多种哺乳动物细胞, 并在合适的哺乳动物启 动子控制下表达外源基因。
在杆状病毒基因序列内插入调控昆虫生理及发育 的激素或酶的基因,以杆状病毒作为外源基因载体, 在宿主昆虫体内过量表达这些激素和酶,从而干扰 昆虫正常的生理反应,以达到使昆虫减少或停止取 食和加速其死亡的目的。
利尿激素(diuretic hormone,DH) 保幼激素酯酶(juvenile hormone esterase,JHE) 促前胸腺激素(prothoracotropic hormone,PTTH) 蜕皮激素(moulting hormone,MH) 羽化激素(eclosion hormone,EH) 几丁质酶(chitinase) 反义RNA
基因组内非必需基因的重组和修饰
• 杆状病毒基因组中存在一些对病毒复制、增殖非 必需的基因,其作用仅在于有利于杆状病毒在感染 末期最大限度的增殖及释放子代病毒。通过对这 部分基因的修饰或缺失,可提高杆状病毒的杀虫效 果。 egt（蜕皮甾体尿苷二葡萄糖转移酶） • pp34 • pe (多角体套膜蛋白基因) • p10 (多功能蛋白基因，参与PE的形成) • P74
利用昆虫杆状病毒防治农业、林业、卫生害 虫是害虫防治的一个重要发展方向
昆虫杆状病毒研究活跃
• 作为外源基因的高效表达载体用于基 因工程的研究；
• 作为基因转移载体用于基因治疗； • 作为生物杀虫剂用于虫害的生物防治
昆虫杆状病毒
杆昆虫杆状病毒是一类专门寄生节肢动物的病原微生 物。 基因组大小为 80-180kb, DNA 分子呈超螺旋双链闭合环状 结构特异，侵染方式特别
插入外源毒素基因
在杆状病毒中插入对昆虫神经系统特异性外源基 因,以提高杀虫效果。
• 钳蝎(Buthus eupeus)毒素(BeIT)基因 • 阿尔及利亚蝎(Androc-tonus australis)神经毒素(AaIT)基 因 • 蝎(Leiurus quinquestriutus hebreus)的LquIT2毒素基因 • 麦杆蒲螨(Pyemotes tritic)神经毒素(TxP-1)基因 • 蜘蛛(Angelenopsis aperat)毒素(u-Aga-IV)基因 • 海葵(Stomphia)的AsⅡ及ShⅠ神经毒素基因 • 苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)的δ-内毒素基因 • 黄蜂(Polistes metricus)毒素基因
杆状病毒宿主域的遗传改造
病毒杀虫谱窄的性质使其应用受到极大的限 制，产生诸如生产、注册、成本高、经济 效益低等一系列问题。 改造方法： 利用异源病毒之间的重组 相关特异基因的研究 反义RNA的重组病毒
杆状病毒杀虫剂的剂型加工和应用
杆状病毒作为活体生物 农药，在防治虫害时 间、吸收方式、生物 活性方面有自身的局 限性，严重影响到了 其推广和应用。除了 从杆状病毒本身改进 外，利用剂型加工进 行实用性的改善和增 效是提高其杀虫效果 的有效方法。