普通PCR仪和荧光定量PCR仪的使用

SG
5’ 3’
SG
3’ 5’
SG
SG
SG
Part IV 荧光定量PCR原理
双标记探针（Taqman Probe）
5’端标记荧光分子（如：FAM），在3’端标记一个吸收
或淬灭荧光的分子（如：TAMRA）， 这样5’端激发出的荧光 会被3’端的分子淬灭或吸收掉，所以开始时，仪器并不能检测
到荧光。由于Taq聚合酶同时具有5’端外切酶的活性，在PCR
Part III 普通PCR仪操作规程

PCR仪软件操作指南：
Gene Amp PCR System 9700 Version 3.05 User:***
Run F1 F1 Stop Creat F2 1 4 7 Edit F3 2 5 8 Util F4 3 6 9 User F5
Enter
0
CE
3’ 末端序列
★
△ 3’ 末端碱基最好为G 或C
△ 3’ 末端碱基尽量避免为T
互补性 特异性
RT-PCR用引物
★★★ ★★★ ★★★
△ 引物内部或两条引物之间避免3 base以上的互补序列 △ 引物3’ 末端避免2 base以上的互补序列
使用BLAST检索，确认引物特异性 尽量在Exon junction上设计引物，限制基因组DNA扩增
• 内掺式染料 SYBR Green I • 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons FRET • 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen)
Part IV 荧光定量PCR原理
SYBR-Green I
dsDNA的内插染料是一种能插入到双链DNA
并发出强烈荧光的化学物质，其荧光强度的 增加与dsDNA的数量成正比。如SYBR GreenⅠ 染料，当它没有结合上双链DNA时，只发出相 对弱的荧光；然而，当它一旦插入到双链DNA
Part V
1、开始运行仪器
荧光定量PCBaidu Nhomakorabea仪操作规程
打开PCR仪底座开关，再打开定量PCR仪检测 器开关。实验前先让系统预热30分钟，打开电脑，启 动iQ5软件。 2、放置样品 将PCR反应体系加入到0.2ml的薄壁管或96孔板 中，盖上管盖。注意，必须带一次性塑料手套，不要 让手指接触到反应管表面。将反应管按顺序放入仪器 的加热孔中。
Part II PCR原理
高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 （℃）
1
2
3
94
重复1-3步 25-30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
时间（min）
4
5
Part II PCR原理
PCR原理
反应性能确认
线性关系、扩增效率确认
相关系数（r2）：大于0.98 PCR扩增效率（E）：0.8-1.2
检测灵敏度确认
35Cycles内可得到好的定量结果。 如果采用SYBR检测方法， 30Cycles内无非特异性产物扩增。
No Template Control确认
30Cycles内无引物二聚体产生。
Part III 普通PCR仪操作规程

PCR仪软件操作指南： Select User Name <<pre>>cql lyf ……
Accept F1 F1 Stop New F2 1 4 7 Edit F3 2 5 8 Delete F4 3 6 9 Cancel F5
Enter
0
CE
Part III 普通PCR仪操作规程
插至双链DNA，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样 品的荧光强度
PCR循环
= 双链DNA = 染料 = 荧光 Green I取代
后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR
EB
Part IV 荧光定量PCR原理
使用Real Time PCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。
激 发 光
Real Time PCR引物设计原则
扩增片段大小 Primer长度
GC含量
Tm值 序列
★ ★ ★ ★★★ ★
80-150 bp(尽量限制在300 bp以内) 17-25 base 40-60%(最好45-55%) 两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值
△ 整体上碱基不能过偏 △ 个别部分避免GC rich或AT rich(特别是3’ 端) △ 避免T/C连续，A/G连续 △ 3’ 末端避免GC rich或AT rich
Part V
荧光定量PCR仪操作规程
3、设置程序，运行实验 定量PCR软件操作基本步骤为：
a. 设置热循环程序文件（Protocol file）
b. 设置反应板文件（Plate Setup file） c. 点击“Run”键,运行程序
d. 数据分析
Part V
4、结果分析
荧光定量PCR仪操作规程
PCR的理论方程：Y=x×(1+ Ev)n Y：扩增物数量； X ：起始模板数量； Ev：扩增效率； n：扩增循环数
Part III 普通PCR仪操作规程
开机操作：
打开PCR仪电源开关； 向后平推PCR仪顶盖，放入PCR薄壁管。 向前平推PCR仪顶盖，并均匀用力将反扣部分压下。
注意：
9700PCR仪必须使用圆头的PCR薄壁管。
里时，荧光信号将会强烈地增加，从而根据
荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加。
Part IV 荧光定量PCR原理
SYBR-Green I
5’
Excitation
SG
Emission
3’
SG
SG
3’
5’
SG
SG
Part IV 荧光定量PCR原理
SYBR-Green I
Excitation
Emission
Enter
0
CE
Part III 普通PCR仪操作规程

PCR仪软件操作指南：
Method Exp000 Exp001
Start F1 F1 Stop
size qin0 9 qin1 9
View F2 1 4 7 User F3 2 5 8
last used 03/01/06 04/10/06
Sort F4 3 6 9 Cancel F5
Enter
0
CE
Part III 普通PCR仪操作规程

PCR仪软件操作指南：
1Hld 94.0 3:00 Edit F1 F1 Stop F2 1 4 7 F3 2 5 8 F4 3 6 9 3Tmp 94.0 0:20 35Cycles 2Holds 55.0 0:20 72.0 0:20 72.0 7:00 4.0 8 Return F5
Ct值
Part IV 荧光定量PCR原理
实时定量PCR技术是PCR技术和荧光检测技术的结
合
通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针， 对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控PCR反
应过程，通过仪器和相应的软件分析结果，对待
测样品的初始模板进行定量或定性分析。
Part IV 荧光定量PCR原理
荧光定量PCR标记方法
普通PCR仪和荧光定量PCR仪的使用
二○一二年十二月
Part I 中心PCR (polymerase chain reaction)仪
简介
Part II PCR 原理
Part III 普通PCR仪操作规程
Part Ⅳ 荧光定量PCR原理 Part Ⅴ 荧光定量PCR仪操作规程
Part I 中心PCR仪简介
普通PCR仪
荧光定量PCR仪 Rotor gene 3000
Gene AMP System 9700
Part II
基因表达 基因水平
PCR
PCR原理
转录水平
（Real time） RT-PCR
翻译水平
Western blot
DNA
mRNA
蛋白
中心法则
核酸的功能是储存 和转移遗传信息， 指导和控制蛋白质的合成； 而蛋白质的主要功能是 进行新陈代谢活动和 作为细胞结构的组成成分。
dNTP（dATP, dGTP, dCTP, dTTP） Mg2+ （magnesium）
模板 （template）
Part II PCR原理
PCR扩增的基本反应步骤
1、变性：加热至95ºC左右，使模板DNA变性。 2、退火：降低温度至适合的温度（55ºC左右， 引物与模板 DNA的互补序列配对结合。 3、延伸：温度在70ºC左右时，Taq DNA聚合酶 从引物3'端催化复制链以5' -3'方向延伸。
对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量
SARS Control RNA 105-101扩增曲线
标准曲线
SARS Internal Control RNA扩增曲线
SARS Genomic RNA Sample 1、２、３扩增曲线
Enter
0
CE
Part III 普通PCR仪操作规程


关机操作：
实验结束后点击Exit至出现主界面，关闭PCR仪电源开关；
均匀用力将反扣部分抬起，向后平推PCR仪顶盖，取出PCR薄壁
管。

向前平推PCR仪顶盖。
Part IV 荧光定量PCR原理

首先，传统的PCR 检测方法在测定PCR 扩增产物前需打开反应管， 容易造成产物污染，成为“假阳性”的主要来源。实时PCR 在扩增过程 中动态检测，完全以闭管方式进行，不仅操作简便，也杜绝了产物污染 源。
Enter
0
CE
Part III 普通PCR仪操作规程

PCR仪软件操作指南：
Method Exp000 Exp001
Edit F1 F1 Stop
size qin0 9 qin1 9
View F2 1 4 7 User F3 2 5 8
last used 03/01/06 04/10/06
Sort F4 3 6 9 Cancel F5
Enter
0
CE
Part III 普通PCR仪操作规程

PCR仪软件操作指南：
1Hld 94.0 3:00 Start F1 F1 Stop F2 1 4 7 F3 2 5 8 F4 3 6 9 3Tmp 94.0 0:20 35Cycles 2Holds 55.0 0:20 72.0 0:20 72.0 7:00 4.0 8 Return F5
蛋白/ 酶 AAAA
Part II
PCR概念

PCR原理
利用DNA聚合酶、一对引物和四种
dNTP（三磷酸脱氧核苷酸），对模板DNA
反复多次地进行复制，从而得到大量扩增产 物的反应过程，称为PCR。
Part II
PCR反应五要素

PCR原理
引物（primer） 酶 （Taq DNA polymerase）
3’ 5’ R Q
Q
5’
3’
Real Time PCR引物设计
Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同 普通PCR引物 目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求 不严格。
Real Time PCR引物
目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和 引物二聚体要求严格。 => 对引物设计要求严格
（1）PCR反应结束后，软件会自动计算标准曲线和Ct 值等。
（2）如需进行表达量分析、等位基因分析等， 在软件 窗口选择相应分析功能。
（3）点击右上方的“Report”键，还可输出结果报告 单 5、关闭运行仪器 实验结束后关闭iQ5软件、荧光定量检测器及扩 增系统电源，关闭电脑，取出反应管。
绝对定量应用例

PCR仪软件操作指南： User Name___
Accept F1 F1 Stop F2 1 4 7 Backsp F3 2 5 8 F4 3 6 9 abcdefgh ijklmnopq rstuvwxyz
Use ENTER key to select a character. Cancel F5
反应的延伸阶段，Taq酶会把5’端的荧光分子切下，使其与 3’端吸收或淬灭荧光的分子分开，仪器就会检测到荧光信号。 每一个循环，随着PCR扩增产物的增加，荧光信号会增强，从 而根据荧光信号的增强来计算PCR产物扩增量的增加。
Part IV 荧光定量PCR原理
5’
3’
5’ 3’
Excitation Excitation

其次，传统PCR 都是在PCR 到达平台期后进行检测。PCR 经过指 数期后，对反应条件的变化十分敏感，扩增到达平台期的信号强度重现 性很差。实时PCR 方法则在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间 的细小误差尚未放大，因此具有重复性。
Part IV 荧光定量PCR原理
定量PCR技术的产生
1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB内插染料法