干细胞特性以及培养技术交流

如Tcf/Lef转录因子家族对上皮干细胞的分化：

Tcf/Lef与β-Catenin形成转录复合物后，促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。（二）受体介导的细胞-细胞

相互作用

如果蝇的Notch基因产物Notch受体。 Notch的配体为Delta基因产物，两者均为细胞表面跨膜蛋白。两者结合后在果蝇刚毛器的发育中起调节作用的蛋白质。 (图，果蝇刚毛) Notch受体

果蝇的每个刚毛器由一个神经前体细胞发育成，而神经前体细胞又是从含多个神经原细胞的细胞群分化出来的，这种有选择地发育过程，依赖于Notch和Delta的基因调节。

Notch与其配体Delta结合后，通过细胞间相互作用，向细胞核传递抑制信号，对相邻细胞侧向抑制，只使某个神经原细胞获得较强的竞争能力，被选择发育为神经前体细胞。

即当Notch与其配体结合时，干细胞进行非分化性增殖；当Notch活性被抑制时，干细胞进入分化程序，发育为功能细胞。

(三) 胞间基质和整合素

1.胞间基质：即细胞外基质，指分布于细胞外空间，由细胞分泌蛋白和多糖构成的网络结构。

2.作用：细胞外基质可以将细胞粘连在一起，同时还提供一个细胞外网架维持组织结构，通过结合与传递信号分子对细胞存活、增殖、分化、迁移等具有重要影响。

3.细胞外基质的种类：

(1) 胶原

胶原是细胞外基质中的主要框架结构。

目前发现的胶原至少19种。每种胶原的结构特性均与其特定功能相适应。可形成胶原纤维(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型)、三维网络结构(Ⅳ型)的片层胶原。

胶原是构成基底膜的主要成分之一，并与细胞基质中的其它成分一起构成结构与功能的统一体。为干细胞生存及生命活动提供微环境。

(2) 层粘连蛋白(laminin，LN)

层粘连蛋白是基膜的主要功能成分。也是胚胎发育中出现最早的细胞基质成分。

在成体，它存在于上皮下和内皮下紧靠细胞的基底，以及肌细胞和脂肪细胞周围等。

层粘连蛋白的功能：

作为基膜的主要结构成分，促进基膜组装，介导细胞粘着胶原进而铺展，促进生长增殖；诱导细胞分化，是个体发生中出现最早的细胞基质。如成肌细胞分化为肌细胞、间质细胞分化为肾细胞、上皮细胞等。

(3)纤粘连蛋白(fibronectin，FN)

纤粘连蛋白分血浆FN和细胞FN。

血浆FN存在于血浆及各种体液中；

细胞FN存在于细胞外基质(包括某些基膜)及细胞表面。

细胞FN为多聚体，有20种以上。是同一基因的编码产物，转录后由于RNA拼接不同形成多

种异型分子，拼接方式依细胞类型及发育状态而定，从而使细胞产生适合组织需要的FN形式。

即细胞通过控制FN RNA的拼接方式，使其与不同细胞结合及产生特异效应。

FN的功能：主要是介导细胞粘着，以此调节细胞形状和细胞骨架的组装，促进细胞铺展、迁移，并可通过迁移途径决定细胞的分化方向。

如沿富含FN途径迁移的神经脊细胞最终分化为肾上素能神经元，形成神经节。。

4.整合素

(1)是一种通过识别并结合相邻细胞的粘附分子和细胞外基质成分，介导细胞-细胞以及细胞-细胞外基质间的相互作用的受体蛋白质。属于细胞粘连分子。

(2)整合素对干细胞的作用：是促进干细胞的非分化增殖。

(3) 作用机理：

①作为细胞外基质的受体，与配体结合后，启动胞内信号传递的连锁反应，最终影响基因表达，为促进干细胞的非分化增殖提供微环境。

②将干细胞置于组织中的正确位置，使干细胞维持非分化性增殖。

整合素是由α和β两个亚单位形成异二聚体。已发现有16种α和9种β亚单位，可组合成20余种整合素。

与细胞外基质成分结合的整合素主要以β1与9种α亚单位分别构成的异二聚体。

如当β1丧失功能时，上皮干细胞脱离微环境制约，分化成角质细胞。

即细胞外基质通过调节β1整合素的表达和激活，影响干细胞的分布和分化方向。

(4)整合素对干细胞的影响作用过程：

需2步：

一是整合素活化；

二是活化的整合素作用于干细胞。

①整合素活化：

整合素通常不与配体结合，需要经过活化。活化因素是外部信号的刺激，活化过程为胞内信号外传过程。

②整合素对细胞的作用：

作用过程为胞外信号内传：

整合素活化后与配体(如纤粘连蛋白)结合

细胞内→细胞发生反应。

如粘着斑蛋白与骨架系统的组装，激酶磷酸化等，使细胞发生分泌、增殖、分化、迁移等。

活化的整合素又可失活，使粘附的细胞彼此脱离。

即整合素通过与细胞外基质的弱结合，使细胞在不脱离粘附的情况下根据微环境，通过可逆性的结合与解离进行细胞迁移。

第二节胚胎干细胞

1．胚胎干细胞：

从囊胚期(受精后5~7天)胚胎分离到的干细胞称胚胎干细胞。

2．胚胎干细胞的特性：

为全能性干细胞。有如下特性：

3．胚胎干细胞的研究价值：

是发育生物学基础研究的理想模型和有效工具。(图，胚胎干细胞的应用)

一、人胚胎干细胞的获得

要研究胚胎干细胞，首先要获得胚胎干细胞。

(一)获得途径：主要有：

1．从早期胚胎获得

美国Thompson研究小组是从囊胚期胚胎的内细胞团中获得胚胎干细胞：

体外受精卵囊胚期去除滋养层→内细胞团得5株干细胞系

32代(8个月)保持未分化状态。

2．从原始生殖细胞获得

gearhart小组：

流产胎儿性腺嵴原始生殖细胞

获得5个多能干细胞系 7个月不分化。

(图，干细胞获得)

思路：原始生殖细胞是未分化细胞。

3．体细胞移植

分化细胞核(乳腺、皮肤细胞) 去核卵细胞→杂合细胞发育成囊胚胚胎干细胞成体(如多利羊)。

(图，体细胞获得干细胞)

二、胚胎干细胞的主要特征

（一）形态和生化特征

1.形态：细胞体积小，核大，1~多个核仁。离体培养可产生密集的多细胞克隆。

2.生化特征：端粒酶活性高。

3.干细胞物理特性：

如干细胞对Hoechst33324和Rhodamine

123染料不着色。

4. 干细胞表面免疫原性：一般表达胚胎早期的表面抗原，而且有种属差异。

如小鼠胚胎干细胞表达胚胎阶段性特异抗原-1(SSEA-1)，不表达SSEA-3或SSEA-4；

人胚胎干细胞表达SSEA-3或SSEA-4。

(二)干细胞的分离与纯化

1. 借助细胞的生化特征及物理特性，采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即可分离纯化干细胞。

2. 干细胞的理化特征与其分化调控有关，如上皮干细胞高表达β1整合素，介导干细胞与