金钗石斛总生物碱抗秀丽隐杆线虫衰老作用及其机制研究

金钗石斛总生物碱抗秀丽隐杆线虫衰老作用及其机制研究

目的:探究金钗石斛总生物碱(Dendrobium nobile Lindl alkaloids,DNLA)对秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)衰老的作用及其机制研究。方法:野生型秀丽隐杆线虫同期化培养至L4期,随机挑取线虫分为四组:对照组(Control组)、DNLA 0.035μg/m L、0.35μg/m L和3.5μg/m L组。

首先观察不同浓度DNLA对线虫寿命周期的影响;在20℃条件下线虫培养72 h,分别进行35℃热应激实验和百草枯氧化应激实验,观察最佳DNLA浓度是否能提高线虫在胁迫条件下的抗压力应激能力,延长线虫寿命;显微镜观察检测DNLA 对线虫生殖能力、移动能力、吞咽频率和脂褐素荧光强度等寿命相关生理指标的影响;实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR)实验检测DNLA对衰老相关基因线虫FOXO同源物(Orthology of the FOXO in C.elegans,daf-16)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,sod-3)、过氧化氢酶(Catalase,ctl-1)、热休克蛋白(Heat shock protein,hsp16.2)以及哺乳动物nrf2同源物(A homologue of the mammalian nrf2,skn-1)的m RNA表达水平的影响;试剂盒检测SOD酶活力;采用daf-16与绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)结合线虫株TJ356(daf-16::GFP)荧光显微镜下检测daf-16基因核定位情况;突变线虫株CF1038(daf-16缺失)和EUI(skn-1缺失)分别进行寿命实验观测daf-16和skn-1基因缺失后DNLA对线虫生命周期的影响。结果:寿命实验中,DNLA给药后延长野生型线虫寿命,且0.35μg/m L DNLA给药浓度效果最佳。

对照组线虫平均寿命为24.62天,0.35μg/m L DNLA组线虫平均寿命为27.61天,寿命延长12.14%;35℃热应激和2 m M百草枯氧化应激条件下,DNLA能提高线

虫抗压力应激的能力,Paraquat+0.35μg/m L DNLA组与Paraquat组相比,生存曲线右移,生命周期延长,DNLA给药后线虫平均寿命由9.15天延长至10.10天,延长10.38%,而热应激实验中0.35μg/m L DNLA给药作用更为显著,线虫平均寿命从13.33天延长至18天,延长35.03%;与对照组相比,0.35μg/m L DNLA给药组线虫生殖能力和吞咽频率均无明显变化,但其移动能力显著增强,脂褐素沉积减少;0.35μg/m L DNLA给药3天后,daf-16、sod-3、hsp-16.2、ctl-1、skn-1转录水平均明显上调;TJ356线虫株检测daf16核定位显示,给予0.35μg/m L DNLA后,daf-16::GFP荧光定位于细胞质的线虫减少至19.64%,而中间状态分布的线虫则由31.24%提高至61.70%,定位于细胞核内的线虫比例也增加到18.37%,提示DNLA能促进daf-16转移进入细胞核提高daf-16活性从而延长线虫寿命;给药DNLA后SOD酶活力提高40.87%;突变线虫株CF1038和EUI给予DNLA后,与对照组相比寿命未发生明显变化。结论:金钗石斛总生物碱对秀丽隐杆线虫有延缓衰老的作用,其作用机制可能与上调daf-16、skn-1基因,提高抗氧化应激能力有关。