基础生物化学-蛋白质合成

―摆动假说”认为： 碱基间除标准配 对外，还可以有 非标准的配对。
密码子第1、2碱基必需按标准配对，第3碱基 的配对可以有一定灵活性，但不是任意组合。
反密码与密码碱基配对时的摇摆现象
反密码第 1位碱基 密码第 3位碱基 A U C G G C， U U A， G I A， C， U
⑦每个密码子三联体(triplet)决定一种氨基酸 性质相近的氨基酸的密码子排列较近，这有利 于在基因突变时不会引起蛋白质功能的变化。
②特定共聚核苷酸 Speyer 等（ 1963 ）用 2 个碱基的共聚物 (mixed copolymers)破译密码的方法。 以A和C原料合成polyAC。polyAC含有8种不 同的密码子：CCC、CCA、CAA、AAA、 AAC、ACC、ACA和CAC。实验中AC共聚 物作模板翻译出的肽链由6种氨基酸组成， 即Asp、His、Thr、Pro和Lys，其中Pro和 Lys的密码子已证明是CCC和AAA。
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13.1.2 tRNA的结构与功能 在蛋白质生物合成过程中，tRNA主要起转运 氨基酸的作用。由于tRNA分子的同工性，细 胞内tRNA的种类(40多种)比氨基酸的种类多。
tRNA的分子量为25~30kD，沉降常数约4S，由 约80个核苷酸组成，其中含有大量稀有碱基， 如假尿嘧啶核苷(ψ)，各种甲基化的嘌呤和嘧 啶核苷，二氢尿嘧啶(D)和胸腺嘧啶(T)核苷 等。 原核和真核细胞一个tRNA分子一般有10~15个 稀有碱基，其功能不十分清楚。 tRNA中有15~16个核苷酸的种类和位置不变， 为固定核苷酸。其它的为可变核苷酸。
aaRS具有高度的特异性，它既能识别特异的氨 基酸，又能识别携带该氨基酸的特异tRNA。 aaRS对氨基酸有严格的特异性，而对与此氨基 酸相适应的数种同工tRNA则无严格的特异性。
aaRS催化的反应过程分二步进行：首先是氨 基酸被aaRS活化生成结合于酶上的氨酰腺 苷酸（AA-AMP），然后是tRNA的氨基酰 化。 aa-tRNA复合物的形成是非常精确的。tRNA 分子结合到酶上时，识别已结合的AA-AMP， 可将错误的AA-AMP水解掉而加以校正。 一旦一个特殊的氨基酸被连接到tRNA分子上， 在蛋白质合成的后续步骤中便没有任何特异 的识别和校正方式。
⑤密码子有通用性，即不论是病毒、原核生物 还是真核生物密码子的含义都是相同的。 但真核线粒体的密码子有例外： 线粒体中UGA不是终止密码子，而编码Trp； 肽链内的Met由AUG和AUA二个密码子编码， 起始部位的Met由AUG、AUA、AUU和 AGG均可编码； AGA和AGG不是Arg的密码子，而是终止密码 子，即UAA、UAG、AGA和AGG均为终止 密码子。
二级结构的特点 ①3'端含CCA-OH序列。氨基酸接在腺苷酸残 基(A)上，CCA-OH序列称为氨基酸接受臂 (amino acid acceptor arm)。 3‗-端第5~11位核苷酸与5‘-端第1~7位核苷酸形 成螺旋区，称为氨基酸接受臂(amino acid acceptor stem)。
④密码子有简并性(degeneracy)一种氨基酸有 几个密码子的现象称为密码子的简并性。 简并性主要是因密码子第3个碱基发生摆动现 象形成的。密码子的专一性主要由前两个碱 基决定，这对保证物种稳定性有一定意义。 但并不是所有的简并性都是前两个核苷酸相 同。 如GCU，GCC，GCA，GCG都代表Ala。 Met和Trp只有1个密码子，其它氨基酸均有2个 以上密码子，如Arg有6个密码子。
③起始密码子和终止密码子： AUG是起始密码子，也是Met（或者fMet）的 密码子。 原核和真核生物肽链合成的第一个氨基酸都是 Met（或者fMet）；少数细菌中也用GUG做 为起始码（起始位点编码fMet，密码表中编 码Val）；真核生物偶尔也用CUG作起始蛋 氨酸的密码。 密码子UAA，UAG，UGA是肽链成的终止密 码，不代表任何氨基酸，也称无意义密码子。
13 蛋白质生物合成
13.1 蛋白质合成体系 13.2 蛋白质的生物合成 13.3 蛋白质定位
13.1.1 mRNA与遗传密码
蛋白质是由20种氨基酸组成的，不同的蛋白质 中氨基酸排列顺序不同，这种排列顺序是按 照基因中的碱基顺序决定的。
基因的遗传信息在转录过程 中从DNA转移到mRNA， 再由mRNA将遗传信息表 达为蛋白质中氨基酸顺序 的过程称翻译。即蛋白质 的生物合成过程。
⑵遗传密码的破译 基因密码的破译先后经历了五十年代的数学推 理阶段和1961-1965年的实验研究阶段。 物理学家George Gamov（1954）根据DNA中 有4种核苷酸和蛋白质中有20种氨基酸的对 应关系，推理认为3个核苷酸为一个氨基酸 编码，可编64种氨基酸(43=64) 是最理想的。
因为在有四种核苷酸条件下，64是能满足于20 种氨基酸编码的最小数。 Brenner和Grick（1961）根据DNA链与蛋白质 链的共线性(colinearity)，肯定了三个核苷酸 为一个氨基酸编码的推理。随后的实验研究 证明此推理是正确的。
例如，当polyU与核糖体混合时，仅有PhetRNA与之结合；Pro-tRNA特异地与polyC结 合等。 64个三核苷酸(密码子)都可按设想的序列合成， 但有一些三核苷酸序列与核糖体结合不是很 有效，因此不能确定它们是否能为特异的氨 基酸编码。
1。体外翻译系 统 2。人工合成核 酸 3核糖体结合技 术
④重复共聚物(repeating copolymers)破译密码 Nishimura等人应用有机化学和酶学技术，制 备了已知的核苷酸重复序列。蛋白质在核糖 体上的合成可以在这些有规律的共聚物的任 一点开始，并把特异的氨基酸参入肽链。
例如，重复序列CUCUCUCUCU......是多肽 Leu-Ser-Leu-Ser... 或是Ser-Leu-Ser...的 mRNA；使用共聚物构成三核苷酸为单位的 重复顺序。 如(AAG)n，它可合成：polyLys、polyArg和 polyGlu三种类型的多肽，即AAG是Lys的密 码子，AGA是Arg的密码子，GAA是Glu的 密码子。
⑥密码与反密码子的相互识别——变偶性 由于一种tRNA（如Ala-tRNAAla ）能识别几种密码子， 而且某些反密码子中含稀有碱基次黄嘌呤 (I) ，I可 与A、U或C配对。 一般是反密码子的5‘-端碱基与密码子的3‘-端碱基非正 规配对，但能使正确的氨基酸进入非正确的密码子 的现象称为变偶性。 Crick(1966)提出了“摆动（变偶）假说” 解释了此现 象。
1965年破译了所有氨基酸的密码子
13.1.1.3 遗传密码的基本性质 ①密码子的方向性
②读码的连续性 两个密码子之间无任何核苷酸或其它成分加以 分隔，即密码子间无逗号。 因此从起始码AUG开始，三个碱基代表一个氨 基酸，从mRNA的5‗→3‘方向构成一个连续 的读框，直至终止码。 如果在读框中间插入或缺失一个碱基就会造成 移码突变，引起突变位点下游氨基排列的错 误。
13.1.1.2 遗传密码的破译 ⑴遗传密码 mRNA中蕴藏遗传信息的碱基顺序称为遗传密 码（Genetic code）。 mRNA分子上以5‗→3‘方向，从AUG开始每三 个连续的核苷酸（三联体）组成一个密码子 (codon) 。
mRNA中的4种碱基可以组成64种密码子。这 些密码代表了20种氨基酸，同时决定了翻译 过程的起始与终止位置。 每种氨基酸至少有一种密码子，最多的有6种 密码子。通过遗传学和生物化学实验，1966 年编排出了遗传密码字典。
13.1.2.2 tRNA的三维结构 ① tRNA 的 三 维 结 构 (three dimensional structure) 是倒“L‖形。 ②氨基酸接受臂 CCA序列和反密码子处于倒 L 的两端。 ③D环和TψC环形成了倒L的角。不同tRNA倒 L形的角有轻微改变，以允许tRNA在执行不 同功能时改变其功能。
13.1.2.1 tRNA的二级结构 通过对tRNA分子分段酶解和键自由能 (△G)的 计算，证明单股 tRNA 链可通过自身折叠形 成四个螺旋区和四个环的基本结构，类似一 个 三 叶 草 ， 称 为 三 叶 草 结 构 (cloverleaf structure)。
所有的 tRNA均 为三叶草 状结构。
①均聚核苷酸指导均聚肽合成 Nirenberg 和 Mathaei （ 1961 ）合成了 polyU 作 为模板，加入体外无细胞翻译系统中。将翻 译产物分析后，发现合成的肽链中的氨基酸 残基全部是Phe。确认了第一个Phe的密码子 （UUU）。
以polyA和polyC为模板，证明了分别可指导合 成polyLys和polyPro，确定了AAA是Lys的 密码子，CCC是pro的密码子。 但类似的实验不能证明GGG是何种氨基酸的 密码子，因为polyG产生牢固的氢键结合， 形成三股螺旋，而不与核糖体结合。
②TψC环；TψC 环由7个碱基 组成，参与 tRNA与核糖 体表面的结合。
③额外环或可变环(extro variable loop)。碱基 种类和数量（3~18个碱基）高度可变，并富 含稀有碱基。 ④反密码子环(anti-cordon loop)。由7个碱基组 成，处于中间位的3个碱基为反密码子。反 密码子可与mRNA中的密码子结合。毗邻反 密码子的3‗端碱基往往为烷化修饰嘌呤，其5‘ 端为U，即：U-反密码子-修饰嘌呤。
13.1.3 rRNA和核糖体 核糖体(ribosome，核蛋白体）是由rRNA和蛋 白质组成的亚细胞颗粒，位于胞浆内。 一类核糖体附着于粗面内质网，参与分泌性蛋 白质的合成，另一类游离于胞浆，参与细胞 固有蛋白质的合成。
蛋白质合成过程中需要200多种生物大分子参 加，包括核糖体、mRNA、tRNA及多种蛋 白质因子。 用体外翻译系统也可以进行蛋白质的生物合成。 如细菌无细胞系统、动物无核细胞系统、网 织红细胞裂解系统和麦胚系统等。只要加入 外源mRNA模板，则可进行体外翻译。
13.1.1.1 mRNA 原核细胞每个mRNA分子常带有多个功能相关 蛋白质的编码信息，以一种多顺反子的形式 排列，在翻译过程中可同时合成几种蛋白质； 真核细胞每个mRNA一般只带一种蛋白质编码 信息，是单顺反子的形式。
每种氨基酸都只有一种氨酰tRNA合成酶。因 此细胞内有20种氨酰tRNA合成酶。 tRNA分子中的反密码环上反密码子的三个碱 基与mRNA分子中的密码子靠碱基配对原则 而形成氢键，达到相互识别的目的。 但在密码子与反密码子结合时具有一定摆动性。
13.1.2.3 氨酰-tRNA合成酶(aaRS) aaRS存在于细胞浆中，分子量 2.27×104~2.7×105，由一个或几个亚基组成。 单个亚基间的大小差别较大。 aaRS的活性中心一般含有一个或几个-SH基， 它在催化中发挥作用。
不同的蛋白质有各自不同的mRNA，mRNA除 含有编码区外，两端还有非编码区。 非编码区对于mRNA的模板活性是必需的，特 别是5‘-端非编码区在蛋白质合成中可能是与 核糖体结合的部位。 基因中各种序列的一般排列次序为：启动信 号— 5‗-端前导区(非编码区) —编码区—3‗端尾序列(非编码区) — 3‗端终止子。
根据共聚物成份不同的比例和翻译产物中氨基 酸比例亦不同的关系，确定了Asp、Glu和 Thr的密码子含2AlC；His的密码子含1A2C； Thr的密码子也可以含1A2C；Pro为3C或 1A2C；Lys为3A。 但此方法不能确定A和C的排列方式，而只能 显示密码子中碱基组成及组成比例。
③核糖体结合技术 Nirenberg等（1964）建立了aa-tRNA与确定密 码子结合实验的破译密码新方法。 在缺乏蛋白质合成所需的因子的条件下，特异 aa-tRNA可与核糖体-mRNA复合物结合。它 并不一定需要长的mRNA分子，三核苷酸就 可以与核糖体结合。