植物细胞程序性死亡(PCD)的诱导、形态观察

首都师范大学生物实验报告

科目：细胞生物学班级：师范班姓名：王攀学号：1110800065 实验名称：植物细胞程序性死亡（PCD）的诱导、形态观察日期：10.30

一、实验目的：

1、了解植物细胞PCD的概念

2、掌握植物细胞PCD的诱导方法、和统计方法

3、了解动物细胞凋亡过程的方法

二、实验原理：

1、细胞死亡：细胞死亡作为生物体的一种常见现象，在动物细胞中有三种方式：凋亡（apoptosis），自噬（autophagy）和坏死（necrosis）。前两种类型属于细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）。细胞坏死是细胞在遭受极度刺激时引起的细胞死亡，以细胞质膜的破裂为特征，造成内含物的炎性泄露，是一种非正常死亡。细胞的PCD是细胞的一种“主动性”死亡行为，从形态上和功能上都与细胞坏死有很大的不同。

2、植物中细胞程序性死亡（PCD）：目前可依据液泡膜破裂后，是否在细胞质中发生快速降解将PCD分为两个大类。第一类为自溶性（autolytic）PCD，与液泡中的水解酶的释放有关，在液泡破裂后，导致细胞质的快速清除。第二种为非自溶PCD，（non-autolytic），即液泡膜破裂但是没有出现快速的细胞质的清除。目前鉴定细胞的PCD类型，还是以细胞形态学为主。

3、动植物细胞凋亡标准：动物：凋亡：凋亡小体，或者在细胞表面的水泡，感染病原体后在其他细胞中的降解。自噬：自噬小体，自溶酶体，和小的促进细胞溶解的液泡数目的增加坏死：没有上面的定义的标准。植物：自溶：植物膜破裂之后对细胞质的快速清理。非自溶：没有对细胞质的快速清理。其他：染色质浓缩细胞核破裂自我标记信号自食信号细胞膨胀，细胞器膨胀，质膜破裂染色质浓缩。液泡体积增加（细胞质体积减小）需要Ca2+的内流，细胞质皱缩，细胞器膨胀，小泡增多但体积不增加。

三、实验步骤

1、植物细胞凋亡：加入较高浓度的CaCL2诱导，观察和统计诱发产生的PCD细胞。用改良

苯酚品红染色观察PCD细胞核发生染色质凝集（condensation）、趋边化(margination)、产生PCD小泡等形态学上的变化。

（1）形态观察：洋葱内表皮，100mmol/LCaCl2 500mmol/LCaCl2 （注意都用PBS（6.5）配置）处理两小时，用于形态观察和凋亡统计。

（2）PCD计数

2、动物细胞凋亡观察：观看录像。

四、实验材料

洋葱鳞茎内表皮、细胞PCD诱导剂——Ca2+、形态学观察染色液——改良苯酚品红

五、实验结果

1、植物细胞凋亡观察：

A B A：0.1M CaCl2 诱导2h的PCD观察（10*40）B：0.1M CaCl2 诱导2h的PCD观察（10*40）

C D C：0.1M CaCl2 诱导2h的PCD观察（10*40）D：0.1M CaCl2 诱导2h的PCD观察（10*40）

E F E：0.1M CaCl2 诱导2h的PCD观察（10*40）F：0.5M CaCl2诱导20-30min的PCD观察

（10*40）

G H

G：0.5M CaCl2诱导20-30min的PCD观察（10*40）H：0.5M CaCl2诱导20-30min的PCD观察（10*40）

I J

I：0.5M CaCl2诱导20-30min的PCD观察（10*40）J：0.5M CaCl2诱导20-30min的PCD观察（10*40）

K

K：对照组，光镜10X40

（3）观察总结：

<1>经过观察，洋葱内皮细胞都有一定数量的凋亡。没有经过氯化钙的细胞PCD率最低，

其次为低浓度氯化钙处理后的洋葱细胞，PCD率最高的为是经过高浓度氯化钙处理后的洋葱细胞。可见化学胁迫因子氯化钙的浓度越高，对细胞凋亡影响越大。

<2>凋亡的细胞形态也各有不同，有的为细胞核变形，有的为质壁分离现象明显，有的

为细胞膜皱缩，细胞质浓缩，细胞核呈新月形，有的为染色质浓缩聚集，凝聚的染色质与细胞质成分包裹在一起，形成较多的近球状凋亡小体。

2、动物细胞凋亡观察：（看录像）

（1）细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液，线粒体里的细胞色素c通过荧光标记，被染成黄绿色。

（2）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中，红颜色出现，为eat me 信号。

（3）带有红色信号的DNA被切断，膜把细胞质和被切断的dna包成小体，红的包着着蓝的为凋亡小体。被吞噬细胞吞噬掉。

六、改进与建议

1、植物细胞的凋亡主观臆断比较严重，不能肯定或确定它是否凋亡。在给细胞

计数的时候，虽然可以照下来再计数，但是还是有一定困难，希望下一回可以用计数器。

2、植物细胞在高浓氯化钙浸泡下，很多细胞都出现了质壁分离现象，有时可能

会被判断为凋亡，我觉得高浓度氯化钙可以降低一下其浓度。

3、可以将多加几组氯化钙浓度，使其呈梯度递增，结论可能更具有代表性。

4、动物细胞观看录像还是有一些抽象，希望能看到真实操作，或者中文录像。

5、对照组实验下次可以多做几次，提高对比性。