高效液相色谱法(HPLC)

高效液相色谱法(HPLC)

一．概述

色谱法是一种应用范围相当广泛的分离分析技术，它已有近百年的发展史。

二十世纪五、六十年代石油及石油化工的突起促使了GC技术大发展，而七、八十年代生命科学、生化、制药工业的发展推动了HPLC的迅速发展。

目前除分析化学外，生物化学，石油化学，有机化学，无机化学等学科都普遍采用色谱技术。现代高效液相色谱仪，以其高效，快速和自动化等特点成为当代分析仪器中发展最快的仪器。HPLC已成为操作方便、准确、快速并能解决困难分离问题的强有力的分析手段。

1．HPLC的特点

（1）适用范围广

已知有机物中仅20%不经预先化学处理，可用GC分析；而其余80%有机物可用HPLC分析。HPLC适于分离生物、医学大分子和离子化合物，不稳定的天然产物，种类繁多的其它高分子及不稳定化合物。

（2）流动相及固定均与样品分子作用，而GC仅固定相与样品分子作用。

（3）具有独特性能的柱填料（固定相）种类较多，具有多种分离方式，适于各种化合物分析。

（4）分离温度较低，提高了分离效率。

（5）具有一些独特的检测器：电化学，示差折光，可见紫外吸收及荧光检测器等。

（6）样品易回收。

2．HPLC分类

按分离机理分为四类：

吸附色谱（液固）：

通过试样组分对活性固体表面吸附亲合力的不同实现分离。对具有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性，早期应用较多，现在大多可用正相键合相色谱替代，常用硅胶柱。

分配色谱：

不同溶质分子按其在固定相和流动相中分配系数不同得到分离。现代分配色谱即化学键合相色谱，是将各种不同的有机基团通过化学反应键合到硅胶表面，具有很好的化学稳定性和热稳定性。大部分分离问题都可用键合相色谱解决。

离子交换色谱：

以离子交换剂为固定相，试样中电离组分与交换剂基体相反电荷的离解部位亲合力不同而分离。用于分离无机或有机离子。固定相为阴（阳）离子交换树脂，流动相为电解质溶液。

分子排阻色谱：

按物质分子量大小进行分离。不仅对高聚物，对分子量差别较大的低聚物或小分子化合物也可进行分离。它又分为用于非水体系的凝胶渗透色谱（GPC），用于高聚物分子量及其分布的测定。又有适于分离和表征水溶性高聚物的凝胶过滤色谱。分子排阻色谱主要用于生物化学和高分子化学，在有机化学中应用也日益增多，已成为HPLC的一个重要分支。

上述四种是HPLC的重要分支，各有不同分离机理和应用领域，各有独到之处。

3．气相色谱的基本理论对HPLC的发展起了指导和推动作用，并自然延伸到液相色谱。

二．液相色谱仪

HPLC流程

现代HPLC按用途分为分析型、制备型、专用型（GPC），其基本部件相同。HPLC仪由输液系统，进样系统，柱系统、检测和记录系统组成。高压泵，色谱柱和检测器为三大关键部件。

4．溶剂贮存器和溶剂脱气

（1）简单的贮液器为500ml 试剂瓶，盖严，防溶剂挥发，瓶内泵吸液管端装10ul不锈钢烧结滤头过滤溶剂。溶剂应预先过滤。

（2）流动相脱气

流动相进泵前必须脱气，尤其是水和极性溶剂。否则过柱以后，压力降低放出溶解的空气。气泡将影响分离效率、基线不稳使检测器灵敏度降低，甚至不能正常工作。

脱气法：微型真空泵在线脱气，适于单一溶剂（如GPC）。吹H e脱气，如H e脱气机在线脱气。超声波脱气等。

5．输液系统一高压泵

色谱柱用细粒填料，填充紧密，液体流动相粘度高，阻力大，必须高压输液。泵为关键部件，直接影响整个仪器和分析结果的可靠性。

要求：A 输出压力高：一般为150~300kg/cm2压力，最高达500 kg/cm2.

B流量范围宽：0.1~10ml/min 连续可调

C 流量稳定: 流量恒定无脉冲,流量精度及重现性为+/- 0.5% 左右。

D 耐腐蚀：耐各种有机溶剂、水和缓冲溶液。

E 密封性好：泵室小便于清洗维修。

泵分为两类：恒流泵：柱阻力变化，流动相粘度变化，引起柱压变化而流量恒定，如往复柱塞泵。恒压泵：流量可随外界阻力变化而输出压力恒定，如装柱用的气动泵。HPLC广泛采用往复柱塞泵，由液缸，柱塞，单向阀和驱动机构组成。密封圈耐磨（PTF-石墨）单向阀，柱塞为人造红宝石。

泵流量不稳使保留变化，直接影响峰面积重现性和定量精度，使噪音变大，最小检测量变大。

双柱塞泵流量平稳，输液精度高，流量精量+/-0.1% ，流量准确度+/-1% 。

双柱塞泵液缸容积很小（几微升~几百微升）适于梯度洗脱。

为提供无脉动的准确流量，在输液系统中还需加一些辅助设备：过滤器、混合器、阻尼器，测压装置。多元混合溶剂需用比例阀，如二元、三元和四元比例阀。溶剂按预定比例，低压混合后，经高压泵输入系统。

6．进样系统

HPLC采用六通阀进样，重现性好，操作方便，易于自动化，大大提高了分析精度。

注射器进样：绝对误差在5%左右，相对误差在1%。

阀进样：误差均在1%以内。进样量由定体积定量管和平头微量注射器控制，注射器体积应为定量管体积的2~3倍。HPLC柱可注入较大体积的稀溶液，进样体积在10~250ul。

7．色谱柱

HPLC发展与柱技术的突破是分不开发。色谱柱是色谱仪的心脏，靠它实现分离。

柱要求：分离效率高，柱容量大，分析速度快。

色谱柱由柱管、凝胶填料、密封环、过滤板等部件组成。色谱柱要耐高压，耐腐蚀，抗氧化密封不漏液，柱内死体积小。对填料质量和装柱技术有严格要求。每根柱都附有测试谱图、色谱条件和柱效、对称因子等数据，供用户判断柱质量。

色谱柱均用指定溶剂充满，防干裂和空气氧化，因而应定期用指定溶剂冲洗。分析后，不能马上关机，应继续冲洗一段时间，保持柱内清洁。调流速时，逐渐增减柱压，压力陡然升降，易使柱内形成沟槽损坏。

保护柱：在分析柱入口端加5~50mm与分析柱固定相相同的短柱，吸留过滤流动相及样品中的有害组分，可经常更换，起到保护延长分析柱的作用，加保护柱虽然柱效有所损失，但在经济和实用方面是有益的。

8．HPLC检测器

连续地将柱中流出组分的含量随时间的变化，转变为易于测量的电信号记录为样品组分的分离谱图，进行定性定量分析。

在液相状态，流动相和样品的许多物理性质十分接近，找到既通用又灵敏的检测器是困难的。相对GC而言，HPLC检测器是有待进一步发展的薄弱环节。对检测器的要求：灵敏度高；对所有组分响应；线性范围宽，响应快；不易被溶剂腐蚀；死体积小，对流速，温度不敏感；操作方便。

通用型检测器：测定流出物（溶质+溶剂）某种整体参数的变化，如折射率，电导率，介电常数等。

示差折光检测器（RID）：通过连续测定流出液折光指数变化来测定样品