DNA的粗提取与鉴定课件

DNA的鉴定
DNA遇二苯胺（沸水浴） 会变蓝，因此，二苯胺可 以作为鉴定DNA的试剂。
• 溶Leabharlann Baidu：在物质的量浓度为2mol/L的 NaCl溶液5mL，放入丝状物，用玻 璃棒搅拌，使之溶解。 • 显色：加入4mL的二苯胺试剂。混 合均匀后，将试管置于沸水中加热 5min。
• 问题：如果溶液变蓝是否能说明DNA 的存在? • 设置对照组
实验材料的选取
材料：鱼卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香 蕉、鸡血、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、 在液体培养基中培养的大肠杆菌 原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以 考虑，但是，选用DNA含量相对较高的生 物组织，成功的可能性更大
• 鸡是真核生物，真核生物的DNA都在染色 体上。 • 鸟类的血细胞核大，DNA多 • 不需要破除细胞壁 • 问题：鸡血细胞液在取材之后，到实验前， 是否需要特殊处理吗？ • 柠檬酸钠抗凝
DNA在酒精溶液中的溶解性 DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些 物质则可以溶于酒精。利用这一原理， 可以将DNA与蛋白质进一步分离
• 蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没 有影响 • 大多数蛋白质不能忍受60－80°C的 高温，而DNA在80°C以上才会变性 • 洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除 脂质和蛋白质,但对DNA没有影响
DNA遇二苯胺
（沸水浴）会 变蓝，因此， 二苯胺可以作 为鉴定DNA的 试剂。
实验操作小结： 制备鸡血细胞液…………加柠檬酸钠，静置或离心 ↓ 破碎细胞，释放DNA… 加蒸馏水，同一方向快速 搅拌 ↓→过滤，除去细胞膜等。 溶解核内DNA………… 加入NaCl至2mol/L，同一 方向缓慢搅拌 ↓
DNA溶解在浓度较高的NaCl溶液溶液中
在 NaCl 溶 液 浓 度 低 于 0.14 DNA的溶解性 当氯化钠的物质的量浓度为
mol/L 时 ， DNA 的 溶 解 度 随 2 mol ／ L 时， DNA 的溶解度 NaCl溶液中溶解度不 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的 NaCl 溶液浓度的增加而逐渐 最大，浓度为 0mol/L ． 14 时 mol ／ 降 低 ； 在 0.14 ， 同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使 DNA充分溶解， L 时， DNA 的溶解度最低。利 DNA 溶解度最小；当 NaCl 溶 用这一原理，可以使 DNA 在 而使杂质沉淀，或者相反 液浓度继续增加时， DNA 的 盐溶液中溶解或析出 溶解度又逐渐增大。
DNA在酒精溶液中的溶解性
DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中 的某些物质则可以溶于酒精。利 用这一原理，可以将DNA与蛋白质 进一步分离
预冷的酒精，可以促进DNA的凝集
• 将DNA粘稠物再溶解，继续用2mol/L的 NaCl溶液20mL溶解DNA黏稠物，仍旧沿一 个方向不停搅拌3min，使DNA充分溶解。 • 过滤:用3～4层纱布进行过滤，滤去杂质， 收集含有DNA的滤液。 • 纯化：向滤液中贴壁缓慢加入50mL预冷的 体积份数为95%乙醇，并用玻璃棒朝一个 方向缓慢、均匀地搅拌，溶液中会出现 DNA丝状物。
DNA析出……………… 加蒸馏水至0.14mol/L， 过滤，再溶解到2mol/L溶液中 ↓→除去细胞质中的大部分物质。 DNA初步纯化………… 与等体积95％冷却酒 精混合，析出白色丝状物 ↓→除去核蛋白、RNA、多糖等。 DNA鉴定……………… 二苯胺，沸水浴，呈 现蓝色
• 洗涤剂的作用： • 洗涤剂也分为亲水基团和 亲脂基团，可以与细胞膜 中的蛋白质结合，使之溶 解，进而瓦解细胞膜。 • 食盐的作用： • 食盐中主要含有NaCl，有 利于DNA的溶解。
• 过滤：用3～4层纱布对DNA稀释 液进行过滤，滤过蛋白质，收集 DNA的粘稠物。
• 问题：这时的滤液可能含有哪些细胞 成分？ • 主要有DNA、RNA、核蛋白、多糖等 • 我们应该如何将DNA单独分离出来？
• 除了可以使用二苯胺法，还有什 么方法可以鉴定DNA？ • 用甲基绿溶液直接滴在有DNA丝 状物的载玻片或玻棒上，呈绿色 反应
在 NaCl 溶 液 浓 度 低 于 0.14 mol/L 时 ， DNA 的 溶 解 度 随 NaCl 溶液浓度的增加而逐渐 降低；在 0.14 mol/L 时， DNA 溶解度最小；当 NaCl 溶液浓 度继续增加时， DNA 的溶解度 又逐渐增大。
• 缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一 个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA 分子的附着和缠绕。同时应注意控制 加水量，使NaCl溶液的终浓度为0.1～ 0.2mol/L，直到溶液中丝状物不再增加 时为止。
• 方案二：直接在滤液中加入嫩肉粉，反应1015min • 嫩肉粉的主要成分是木瓜蛋白酶 • 蛋白酶能分解杂质蛋白，但对DNA没有影响， 从而使提取的DNA与蛋白质分开 • 方案三：将滤液放在60-75℃的恒温水浴箱中 保温10-15min。 • 大多数蛋白质不能忍受60-80 ℃的高温，而 DNA在80 ℃以上才会变性 • 利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同， 从而使蛋白质变性，与DNA分离。
问题：鸡血细胞虽然没有细胞壁，但是 依然有细胞膜，以你所学的知识，有什 么比较简便但是可行的方法可以破碎细 胞膜？
讨论：为什么 加入蒸馏水能 使鸡血细胞破 裂？
对于动物细胞我们可以利用细胞 的渗透压来破碎细胞，但是很多 情况下，人们不得不面对植物材 料，那么我们是不是还可以通过 加入一定量的蒸馏水来涨破细胞 呢？
①根据DNA在NaCl溶液中的溶 ②如何通过控制 NaCl溶液的浓 解度曲线图，思考在什么浓 度使 DNA 在盐溶液中溶解或析 度下 ， DNA 的溶解度最小？ 出？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是 如何变化的？
• 用高浓度的盐溶液溶解DNA，能 除去在高盐中不能溶解的杂质；用 低盐浓度使DNA析出，能除去溶 解在低盐溶液中的杂质。