新发呼吸道传染病的病原体检测技术及应用
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诊断快速 特异性高 灵敏度高
Real-time (RT-)PCR
扩增曲线
疱疹病毒科 单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、水痘－带状疱疹病毒
披膜病毒科 风疹病毒
多瘤病毒 WU、KI
5
近年来新发现的呼吸道病毒
- 人感染高致病性禽流感病毒 - 亨德拉/尼帕病毒 - 偏肺病毒 - SARS冠状病毒 - 冠状病毒NL63 - 冠状病毒HKU1 - 博卡比病毒1型 - 多瘤病毒KI - 多瘤病毒WU - C种鼻病毒 - Saffold心病毒 -甲型H1N1流感病毒 -冠状病毒HCoV-EMC/2012 -新型H7N9流感病毒 -EV-D68
•Addition to the previous reported two patients with drug-resistant mutation, 292K
mutant was also found in the sputa from other two patients, case No.8 and No.10 after
• 病毒抗体检测
» 急性期血清中病毒特异性IgM迅速出现 » 双份血清确认引发疾病的感染病原
实验结果稳定 检测快速（2-3小时）
核酸诊断
核酸分子杂交 聚合酶链反应（PCR） 核酸定量分析 基因芯片
核酸的直接检测 定性PCR 单对引物PCR
核酸扩增检测(PCR)
定量PFra Baidu bibliotekR
多重PCR
基因芯片
Reverse Transcription(RT)- PCR 优势：
病毒分离培养和鉴定
胶体金免疫层析技术
（GICA）
检测示意图
检测靶点
• 抗原
• 抗体（IgM、IgG）
。
检测靶点
• RSV • 腺病毒 • 衣原体 • 。。。
应 用 领 域 及 优 势
人感染禽流感的快速诊断
？
能否适用
H5N1 禽流感病毒与人流感病毒不同,气管上皮感染较少, 主要感染肺组织 （免疫组化）
对已知传染病要尽快明确诊断 对未知新发传染病要查病因
2021/4/13
呼吸道病毒实验室诊断技术的发展
模糊 非扩增 不敏感 慢 定性 单一 已知
明确 扩增 敏感 快 定量 高通量 未知
• 医疗需求---原动力 • 技术革命---推动力 • 跨学科交叉---加速力
诊断病毒学 Diagnostic Virology
检测示意图
直接免疫荧光检测病毒抗原
临床应用
Influenza A RSV
Influenza B Negative
间接免疫荧光检测病毒抗体
临床应用
基于ELISA的病毒抗原/抗体检测
病毒抗体检测（血清学检测）的重要性
• 病毒核酸和抗原检测
» 采样的时间 » 采样的部位 » 采样的技术 » 病毒复制水平
直接检测方法 ☺ 病毒分离培养 ☺ 电镜 (EM) ☺ 病毒抗原检测 ☺ 病毒核酸DNA/RNA检测
间接检测方法 ☺ 抗体检测 / 血清学检测 ☺ 病毒特异性淋巴细胞激活 ☺ 抗原刺激下的细胞因子释放
新发呼吸道病毒的检测方法
检测病毒抗原: 胶体金层析 免疫荧光
检测病毒核酸： PCR 多重PCR 生物芯片 深度测序
新发呼吸道传染病的病原体 检测技术及应用
呼吸道病毒严重威胁人类健康
1.15亿DALYs 约280万 5岁以下
Lancet, 2012, 380: 2095-128; 2197-223
The 1918 flu pandemic (January 1918 – December 1920)
• 1918 Spanish Flu killed 20 million people.
• Highest number of deaths were in people in their late teens through mid 30’s
Recent outbreaks
Ebola virus
MERS-CoV
Avian Flu (H5N1/H7N9)
4
常见的人呼吸道病毒
正粘病毒科 流感病毒（A、B、C）
initiating antiviral treatment
Wang etal. Emerging Infectious Disease 2014
19
方法学应用的局限性
• 对于主要感染下呼吸道的禽流感病毒，由于病 毒在上呼吸道细胞中的复制水平较低，胶体金 免疫层析法的检出率较低，导致漏检发生。
免疫荧光
H7N9 禽流感病毒在人支气管和肺组织中均能感染
Validation of the developed method in paired upper and lower respiratory specimens from the H7N9 cases
•Higher detection rate in the sputum samples
副粘病毒科 副流感病毒（I-IV）、呼吸道合胞病毒、
偏肺炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒
小RNA病毒科 鼻病毒、肠道病毒、Parechovirus、心病毒
腺病毒科
腺病毒
冠状病毒科 SARS-CoV, 229E, OC43, NL63, HKU1, HBCoV-EMC
细小病毒
博卡病毒（1-4）
呼肠孤病毒科 正呼肠孤病毒属
1997 2000 2001 2003 2004 2004 2005 2007 2007 2007 2008 2009 2012
2013 2014
引起呼吸道感 染的病毒还有 未被发现的吗？
新发传染病与病毒生态系统
Bat-borne virus
Mammalian reservoir
中间宿主 Ebola virus Marburg virus Nipah virus Other severe acute respiratory syndrome agent (e.g. SARS-CoV)
应对新发传染病
• 诊断能力 • 疫苗研发能力 • 发现有效的抗病毒药物 • 建立疾病模型
2021/4/13
“快速诊断”是关键
在人类与传染病的斗争中，诊断、治疗和 预防是三个关键环节。其中，及时正确诊 断最为关键，是有效治疗的基础，也是制 定预防策略的依据。
及时发现、有效鉴别、快速诊断和提出预 警，这是现代传染病防治体系的最前沿
Real-time (RT-)PCR
扩增曲线
疱疹病毒科 单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、水痘－带状疱疹病毒
披膜病毒科 风疹病毒
多瘤病毒 WU、KI
5
近年来新发现的呼吸道病毒
- 人感染高致病性禽流感病毒 - 亨德拉/尼帕病毒 - 偏肺病毒 - SARS冠状病毒 - 冠状病毒NL63 - 冠状病毒HKU1 - 博卡比病毒1型 - 多瘤病毒KI - 多瘤病毒WU - C种鼻病毒 - Saffold心病毒 -甲型H1N1流感病毒 -冠状病毒HCoV-EMC/2012 -新型H7N9流感病毒 -EV-D68
•Addition to the previous reported two patients with drug-resistant mutation, 292K
mutant was also found in the sputa from other two patients, case No.8 and No.10 after
• 病毒抗体检测
» 急性期血清中病毒特异性IgM迅速出现 » 双份血清确认引发疾病的感染病原
实验结果稳定 检测快速（2-3小时）
核酸诊断
核酸分子杂交 聚合酶链反应（PCR） 核酸定量分析 基因芯片
核酸的直接检测 定性PCR 单对引物PCR
核酸扩增检测(PCR)
定量PFra Baidu bibliotekR
多重PCR
基因芯片
Reverse Transcription(RT)- PCR 优势：
病毒分离培养和鉴定
胶体金免疫层析技术
（GICA）
检测示意图
检测靶点
• 抗原
• 抗体（IgM、IgG）
。
检测靶点
• RSV • 腺病毒 • 衣原体 • 。。。
应 用 领 域 及 优 势
人感染禽流感的快速诊断
？
能否适用
H5N1 禽流感病毒与人流感病毒不同,气管上皮感染较少, 主要感染肺组织 （免疫组化）
对已知传染病要尽快明确诊断 对未知新发传染病要查病因
2021/4/13
呼吸道病毒实验室诊断技术的发展
模糊 非扩增 不敏感 慢 定性 单一 已知
明确 扩增 敏感 快 定量 高通量 未知
• 医疗需求---原动力 • 技术革命---推动力 • 跨学科交叉---加速力
诊断病毒学 Diagnostic Virology
检测示意图
直接免疫荧光检测病毒抗原
临床应用
Influenza A RSV
Influenza B Negative
间接免疫荧光检测病毒抗体
临床应用
基于ELISA的病毒抗原/抗体检测
病毒抗体检测（血清学检测）的重要性
• 病毒核酸和抗原检测
» 采样的时间 » 采样的部位 » 采样的技术 » 病毒复制水平
直接检测方法 ☺ 病毒分离培养 ☺ 电镜 (EM) ☺ 病毒抗原检测 ☺ 病毒核酸DNA/RNA检测
间接检测方法 ☺ 抗体检测 / 血清学检测 ☺ 病毒特异性淋巴细胞激活 ☺ 抗原刺激下的细胞因子释放
新发呼吸道病毒的检测方法
检测病毒抗原: 胶体金层析 免疫荧光
检测病毒核酸： PCR 多重PCR 生物芯片 深度测序
新发呼吸道传染病的病原体 检测技术及应用
呼吸道病毒严重威胁人类健康
1.15亿DALYs 约280万 5岁以下
Lancet, 2012, 380: 2095-128; 2197-223
The 1918 flu pandemic (January 1918 – December 1920)
• 1918 Spanish Flu killed 20 million people.
• Highest number of deaths were in people in their late teens through mid 30’s
Recent outbreaks
Ebola virus
MERS-CoV
Avian Flu (H5N1/H7N9)
4
常见的人呼吸道病毒
正粘病毒科 流感病毒（A、B、C）
initiating antiviral treatment
Wang etal. Emerging Infectious Disease 2014
19
方法学应用的局限性
• 对于主要感染下呼吸道的禽流感病毒，由于病 毒在上呼吸道细胞中的复制水平较低，胶体金 免疫层析法的检出率较低，导致漏检发生。
免疫荧光
H7N9 禽流感病毒在人支气管和肺组织中均能感染
Validation of the developed method in paired upper and lower respiratory specimens from the H7N9 cases
•Higher detection rate in the sputum samples
副粘病毒科 副流感病毒（I-IV）、呼吸道合胞病毒、
偏肺炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒
小RNA病毒科 鼻病毒、肠道病毒、Parechovirus、心病毒
腺病毒科
腺病毒
冠状病毒科 SARS-CoV, 229E, OC43, NL63, HKU1, HBCoV-EMC
细小病毒
博卡病毒（1-4）
呼肠孤病毒科 正呼肠孤病毒属
1997 2000 2001 2003 2004 2004 2005 2007 2007 2007 2008 2009 2012
2013 2014
引起呼吸道感 染的病毒还有 未被发现的吗？
新发传染病与病毒生态系统
Bat-borne virus
Mammalian reservoir
中间宿主 Ebola virus Marburg virus Nipah virus Other severe acute respiratory syndrome agent (e.g. SARS-CoV)
应对新发传染病
• 诊断能力 • 疫苗研发能力 • 发现有效的抗病毒药物 • 建立疾病模型
2021/4/13
“快速诊断”是关键
在人类与传染病的斗争中，诊断、治疗和 预防是三个关键环节。其中，及时正确诊 断最为关键，是有效治疗的基础，也是制 定预防策略的依据。
及时发现、有效鉴别、快速诊断和提出预 警，这是现代传染病防治体系的最前沿