新发呼吸道传染病的病原体检测技术及应用
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新发呼吸道传染病的病原体 检测技术及应用
呼吸道病毒严重威胁人类健康
1.15亿DALYs 约280万 5岁以下
Lancet, 2012, 380: 2095-128; 2197-223
The 1918 flu pandemic (January 1918 – December 1920)
• 1918 Spanish Flu killed 20 million people.
对已知传染病要尽快明确诊断 对未知新发传染病要查病因
2021/4/13
呼吸道病毒实验室诊断技术的发展
模糊 非扩增 不敏感 慢 定性 单一 已知
明确 扩增 敏感 快 定量 高通量 未知
• 医疗需求---原动力 • 技术革命---推动力 • 跨学科交叉---加速力
诊断病毒学 Diagnostic Virology
疱疹病毒科 单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、水痘－带状疱疹病毒
披膜病毒科 风疹病毒
多瘤病毒 WU、KI
5
近年来新发现的呼吸道病毒
- 人感染高致病性禽流感病毒 - 亨德拉/尼帕病毒 - 偏肺病毒 - SARS冠状病毒 - 冠状病毒NL63 - 冠状病毒HKU1 - 博卡比病毒1型 - 多瘤病毒KI - 多瘤病毒WU - C种鼻病毒 - Saffold心病毒 -甲型H1N1流感病毒 -冠状病毒HCoV-EMC/2012 -新型H7N9流感病毒 -EV-D68
• 病毒抗体检测
» 急性期血清中病毒特异性IgM迅速出现 » 双份血清确认引发疾病的感染病原
实验结果稳定 检测快速（2-3小时）
核酸诊断
核酸分子杂交 聚合酶链反应（PCR） 核酸定量分析 基因芯片
核酸的直接检测 定性PCR 单对引物PCR
核酸扩增检测(PCR)
定量PCR
多重PCR
基因芯片
Reverse Transcription(RT)- PCR 优势：
诊断快速 特异性高 灵敏度高
Real-time (RT-)PCR
扩增曲线
initiating antiviral treatment
Wang etal. Emerging Infectious Disease 2014
19
方法学应用的局限性
• 对于主要感染下呼吸道的禽流感病毒，由于病 毒在上呼吸道细胞中的复制水平较低，胶体金 免疫层析法的检出率较低，导致漏检发生。
免疫荧光
H7N9 禽流感病毒在人支气管和肺组织中均能感染
Validation of the developed method in paired upper and lower respiratory specimens from the H7N9 cases
•Higher detection rate in the sputum samples
应对新发传染病
• 诊断能力 • 疫苗研发能力 • 发现有效的抗病毒药物 • 建立疾病模型
2021/4/13
“快速诊断”是关键
在人类与传染病的斗争中，诊断、治疗和 预防是三个关键环节。其中，及时正确诊 断最为关键，是有效治疗的基础，也是制 定预防策略的依据。
及时发现、有效鉴别、快速诊断和提出预 警，这是现代传染病防治体系的最前沿
检测示意图
直接免疫荧光检测病毒抗原
临床应用
Influenza A RSV
Influenza B Negative
间接免疫荧光检测病毒抗体
临床应用
基于ELISA的病毒抗原/抗体检测
病毒抗体检测（血清学检测）的重要性
• 病毒核酸和抗原检测
» 采样的时间 » 采样的部位 » 采样的技术 » 病毒复制水平
直接检测方法 ☺ 病毒分离培养 ☺ 电镜 (EM) ☺ 病毒抗原检测 ☺ 病毒核酸DNA/RNA检测
间接检测方法 ☺ 抗体检测 / 血清学检测 ☺ 病毒特异性淋巴细胞激活 ☺ 抗原刺激下的细胞因子释放
新发呼吸道病毒的检测方法
检测病毒抗原: 胶体金层析 免疫荧光
检测病毒核酸： PCR 多重PCR 生物芯片 深度测序
1997 2000 2001 2003 2004 2004 2005 2007 2007 2007 2008 2009 2012
2013 2014
引起呼吸道感 染的病毒还有 未被发现的吗？
新发传染病与病毒生态系统
Bat-borne virus
Mammalian reservoir
中间宿主 Ebola virus Marburg virus Nipah virus Other severe acute respiratory syndrome agent (e.g. SARS-CoV)
• Highest number of deaths were in people in their late teens through mid 30’s
Recent outbreaks
Ebola virus
MERS-CoV
Avian Flu (H5N1/H7N9)
4
常见的人呼吸道病毒
正粘病毒科 流感病毒（A、B、C）
•Addition to the previous reported two patients with drug-resistant mutation, 292K
mutant was also found in the sputa from other two patients, case No.8 and No.10 after
副粘病毒科 副流感病毒（I-IV）、呼吸道合胞病毒、
偏肺炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒
小RNA病毒科 鼻病毒、肠道病毒、Parechovirus、心病毒
腺病毒科
腺病毒
冠状病毒科 SARS-CoV, 229E, OC43, NL63, HKU1, HBCoV-EMC
细小病毒
博卡病毒（1-4）
呼肠孤病毒科 正呼肠孤病毒属
病毒分离培养和鉴定
胶体金免疫层析技术
（GICA）
检测示意图
检测靶点
• 抗原
• 抗体（IgM、IgG）
。
检测靶点
• RSV • 腺病毒 • 衣原体 • 。。。
应 用 领 域 及 优 势
人感染禽流感的快速诊断
？
能否适用
H5N1 禽流感病毒与人流感病毒不同,气管上皮感染较少, 主要感染肺组织 （免疫组化）
呼吸道病毒严重威胁人类健康
1.15亿DALYs 约280万 5岁以下
Lancet, 2012, 380: 2095-128; 2197-223
The 1918 flu pandemic (January 1918 – December 1920)
• 1918 Spanish Flu killed 20 million people.
对已知传染病要尽快明确诊断 对未知新发传染病要查病因
2021/4/13
呼吸道病毒实验室诊断技术的发展
模糊 非扩增 不敏感 慢 定性 单一 已知
明确 扩增 敏感 快 定量 高通量 未知
• 医疗需求---原动力 • 技术革命---推动力 • 跨学科交叉---加速力
诊断病毒学 Diagnostic Virology
疱疹病毒科 单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、水痘－带状疱疹病毒
披膜病毒科 风疹病毒
多瘤病毒 WU、KI
5
近年来新发现的呼吸道病毒
- 人感染高致病性禽流感病毒 - 亨德拉/尼帕病毒 - 偏肺病毒 - SARS冠状病毒 - 冠状病毒NL63 - 冠状病毒HKU1 - 博卡比病毒1型 - 多瘤病毒KI - 多瘤病毒WU - C种鼻病毒 - Saffold心病毒 -甲型H1N1流感病毒 -冠状病毒HCoV-EMC/2012 -新型H7N9流感病毒 -EV-D68
• 病毒抗体检测
» 急性期血清中病毒特异性IgM迅速出现 » 双份血清确认引发疾病的感染病原
实验结果稳定 检测快速（2-3小时）
核酸诊断
核酸分子杂交 聚合酶链反应（PCR） 核酸定量分析 基因芯片
核酸的直接检测 定性PCR 单对引物PCR
核酸扩增检测(PCR)
定量PCR
多重PCR
基因芯片
Reverse Transcription(RT)- PCR 优势：
诊断快速 特异性高 灵敏度高
Real-time (RT-)PCR
扩增曲线
initiating antiviral treatment
Wang etal. Emerging Infectious Disease 2014
19
方法学应用的局限性
• 对于主要感染下呼吸道的禽流感病毒，由于病 毒在上呼吸道细胞中的复制水平较低，胶体金 免疫层析法的检出率较低，导致漏检发生。
免疫荧光
H7N9 禽流感病毒在人支气管和肺组织中均能感染
Validation of the developed method in paired upper and lower respiratory specimens from the H7N9 cases
•Higher detection rate in the sputum samples
应对新发传染病
• 诊断能力 • 疫苗研发能力 • 发现有效的抗病毒药物 • 建立疾病模型
2021/4/13
“快速诊断”是关键
在人类与传染病的斗争中，诊断、治疗和 预防是三个关键环节。其中，及时正确诊 断最为关键，是有效治疗的基础，也是制 定预防策略的依据。
及时发现、有效鉴别、快速诊断和提出预 警，这是现代传染病防治体系的最前沿
检测示意图
直接免疫荧光检测病毒抗原
临床应用
Influenza A RSV
Influenza B Negative
间接免疫荧光检测病毒抗体
临床应用
基于ELISA的病毒抗原/抗体检测
病毒抗体检测（血清学检测）的重要性
• 病毒核酸和抗原检测
» 采样的时间 » 采样的部位 » 采样的技术 » 病毒复制水平
直接检测方法 ☺ 病毒分离培养 ☺ 电镜 (EM) ☺ 病毒抗原检测 ☺ 病毒核酸DNA/RNA检测
间接检测方法 ☺ 抗体检测 / 血清学检测 ☺ 病毒特异性淋巴细胞激活 ☺ 抗原刺激下的细胞因子释放
新发呼吸道病毒的检测方法
检测病毒抗原: 胶体金层析 免疫荧光
检测病毒核酸： PCR 多重PCR 生物芯片 深度测序
1997 2000 2001 2003 2004 2004 2005 2007 2007 2007 2008 2009 2012
2013 2014
引起呼吸道感 染的病毒还有 未被发现的吗？
新发传染病与病毒生态系统
Bat-borne virus
Mammalian reservoir
中间宿主 Ebola virus Marburg virus Nipah virus Other severe acute respiratory syndrome agent (e.g. SARS-CoV)
• Highest number of deaths were in people in their late teens through mid 30’s
Recent outbreaks
Ebola virus
MERS-CoV
Avian Flu (H5N1/H7N9)
4
常见的人呼吸道病毒
正粘病毒科 流感病毒（A、B、C）
•Addition to the previous reported two patients with drug-resistant mutation, 292K
mutant was also found in the sputa from other two patients, case No.8 and No.10 after
副粘病毒科 副流感病毒（I-IV）、呼吸道合胞病毒、
偏肺炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒
小RNA病毒科 鼻病毒、肠道病毒、Parechovirus、心病毒
腺病毒科
腺病毒
冠状病毒科 SARS-CoV, 229E, OC43, NL63, HKU1, HBCoV-EMC
细小病毒
博卡病毒（1-4）
呼肠孤病毒科 正呼肠孤病毒属
病毒分离培养和鉴定
胶体金免疫层析技术
（GICA）
检测示意图
检测靶点
• 抗原
• 抗体（IgM、IgG）
。
检测靶点
• RSV • 腺病毒 • 衣原体 • 。。。
应 用 领 域 及 优 势
人感染禽流感的快速诊断
？
能否适用
H5N1 禽流感病毒与人流感病毒不同,气管上皮感染较少, 主要感染肺组织 （免疫组化）