离体家兔主动脉环实验 实验设计

离体兔主动脉环实验

07临床曲宁

一、目的

学习离体器官组织灌流的方法，掌握兔主动脉环制备技术，观察维拉帕米对电压门控通道的阻断作用及酚妥拉明对配体门控钙通道的阻断作用。

二、原理

高浓度的氯化钾液（60～100mmo1）可使血管平滑肌细胞去极化，促使电压门控钙通道开放，引起胞外Ca2+内流，导致血管平滑肌收缩。能阻断高钾液此作用的药物则为电压门控钙通道阻断药。

α受体激动药（如苯肾上腺素）诱导血管收缩是由α1肾上腺素受体的激活造成的，主要通过激活磷脂酶C，产生甘油二脂和三磷酸肌醇（IP3），主要由IP3诱导肌浆网内的Ca2+释放而致血管环（条）收缩，α受体阻断药可阻断此作用。当NE与血管平滑肌细胞α受体结合，可导致血管平滑肌收缩；与ß受体结合则导致血管平滑肌舒张。NE与α受体结合能力较与ß受体结合的能力强，故NE具有很强的血管收缩作用

逐步递增α受体激动药的浓度（累积浓度），引起血管环出现剂量依赖性收缩（可根据剂量调整在一定范围提高疗效），记录药物量效曲线。然后给予α受体阻断药，再重复上述实验，可使该量效曲线平衡右移，但最大效应不变，计算出α受体阻断药的拮抗参数（pA2）以确定该阻断药的阻断效价酚妥拉明(Phentolamine)为短效α-受体阻滞剂，与去甲肾上腺素能神经递质和拟肾上腺素药竞争α-受体而发挥阻滞作用。对α1和α2受体都有阻滞作用，能直接松弛动静脉平滑肌

维拉帕米为Ca离子通道阻滞剂，它在发挥作用前必须通过钙离子通道进入细胞。所以它的作用是与钙离子通道活性直接相关的。维拉帕米作用于开放状态的通道，具有频率依赖性和使用依赖性。

三、材料

1．实验对象健康的兔子，雄性，体重250～280克；

2．实验器材麦氏浴槽，超级恒温水浴，温度计，5g张力换能器，微机生物信号采集处理仪，手术剪刀，眼科剪，眼科镊，培养皿，烧杯，100μl、1m1移液器，棉线；

3．实验药品3mo1/L氯化钾，10-5mo1/L维拉帕米，10-3mo1/L肾上腺素，10g/L酚妥拉明，1mmol/L乙酰胆碱，Krebs液，95%O2+5%CO2混合气体.

四、实验步骤

1、实验系统连接和仪器参数设置

（1）实验装置连接按下图连接装置。将张力换能器固定于微距调节器上，换能器输出线接微机生物信号处理系统输入通道。麦氏浴槽中充以Krebs台氏液至固定水平面，调节超级恒温器的温度至37℃，保证麦氏浴槽内37±0.5℃恒温，

通气管接气瓶（95%O2+5%CO2）管道。调节通气管气流量，通气速度以麦氏浴槽中的气泡一个个逸出为宜。

2、仪器参数设置

（1）RM640系统仪器参数：张力换能器输入通道模式为张力，时间常数为直流，滤波频率10Hz,灵敏度3g，采样频率100Hz,扫描速度25s/div.

（2）PcLab和MedLab系统仪器参数：张力换能器输入通道信号名称为张力，放大倍数200~500、直流耦合、上限频率10Hz,采样间隔5ms.

图11-27-1 血管灌流示意图

用Krebs液反复脱洗标本使其张力回复初始值，间隔30分钟进行下一项目，每隔15分钟换液一次。

3、实验方法

（1）用钝器击晕兔子后，剪开胸腔，迅速取出心脏及胸主动脉放入盛有4℃的混合气体饱和的Krebs营养液的培养皿中，连续用混合气体充气。分离出主动脉，将血管内的残存血液冲洗干净，小心剥去外围的结缔组织，将主动脉弓以下的胸主动脉剪成4mm长的动脉环数段备用。

（2）需要保存内皮的血管，动作应轻柔。如需无内皮的血管环，可用棉签或牙签将血管内皮轻轻檫去。

（3）将血管环固定悬挂于盛有10ml Krebs液的麦氏浴槽内，将固定杆上的不锈钢钩轻轻穿入血管环一侧，并将另一端连接有细线的系于张力换能器上，通入混合气体，调节通气量至一个一个小气泡逸出为好。浴槽内温度应保持

37±0.5℃。

（4）血管环的初始张力前15分钟为1.5g，15分钟后调至2.4g，并以此张力平衡45分钟。每隔15分钟换液一次。

（5）用终浓度60mmol/L KCL（3mol/L KCL 200μl）收缩血管环，待收缩稳定后用预热的Krebs洗脱，反复冲洗直至张力恢复到初始值为止；重复加入同一浓度KCL，连续3次，用Krebs液反复脱洗标本使其张力回复初始值。

（6）用10-3mol/L的肾上腺素100μl（终浓度10-6mol）诱发血管收缩达稳定后，加入10-3mol的乙酰胆碱100μl（终浓度10-6M），观察血管的松弛效应是否

超过10%，如果≥10%则为内皮完整，否则为内皮受损或无内皮。(血管内皮细胞的完整对血管平滑肌舒宿起调节作用，但此实验可以用内皮完整型)

五、观察项目

按以下顺序把药物加于浴槽中：

1．加入3mo1／L氯化钾100μ1，观察并记录动脉环的收缩。Krebs液反复脱洗标本使其张力回复初始值。

2. 加入10-5mo1／L维拉帕米200μ1，15min后再加入3mo1/L氯化钾200μl。记录动脉环收缩，在收缩达高峰后用Krebs液反复脱洗标本使其张力回复初始值。

3. 加入3mo1／L氯化钾100μ1，待曲线上升期间迅速加入维拉帕米，观察曲线变化情况。曲线平稳后用Krebs液反复脱洗标本使其张力回复初始值。

4．加入10-3mo1/L肾上腺素100μ1，记录动脉环的收缩，在反应达高峰时用Krebs液反复脱洗标本使其张力回复初始值

5．20min后，加入10g/L酚妥拉明100μl，10min后再重复观察项目2，记录动脉环的收缩。

6．把主动脉环取出，用滤纸吸去其表面水分，称重。

六、实验结果

记录测定每次加药前后血管环的张力，计算出每次给药后每克动脉环收缩张力，分析实验结果。

K+可以使血管平滑肌细胞去极化，促使电压门控钙通道开放，引起胞外Ca2+内流，导致血管平滑肌收缩。所以加入氯化钾时，张力曲线上升。维拉帕米可以阻断电压门控钙通道，所以加入维拉帕米后再加入氯化钾曲线升高幅度降低。而在加入氯化钾后在曲线上升时加入维拉帕米，则曲线应该迅速趋于平稳。

肾上腺素激动血管的α1受体，使血管收缩，所以张力曲线上升，表明在苯肾上腺素的作用下，主动脉环剧烈收缩。

酚妥拉明具有可以选择性的与α受体结合，从而竞争性的抑制了肾上腺素与α受体结合，使肾上腺素的作用减弱消失，此时再加入肾上腺素则张力曲线无变化。

七、注意事项

1.Krebs必须临用时用新鲜蒸馏水配制。

2.内皮细胞除分泌舒血管物质外，还分泌缩血管物质如ET1、AngⅡ、TXB2。可见内皮细胞对血管张力的调节具有收缩与舒张的双重作用。

3.乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)引起的内皮依赖性舒张反应。

4. 营养液的配制、分离血管时营养液是否充分氧饱和并预冷，营养液PH值，剥离制备血管环方法是否未损伤血管内皮等因素都可已影响实验结果。

5.注意气泡均匀，保持一秒钟一个气泡为最佳。这样既可以满足需要，又不会因为气体的逸出而导致液体的震动，从而影响到传导装置，使曲线发生变化