生物制药 第三章动物细胞工程制药

生物制药第三章动物细胞工程制药第一节概述第二节动物细胞的形态和生理特点第三节生产用动物细胞的要求和获得第四节动物细胞的培养条件和培养基第五节动物细胞培养的方法和操作方式第六节动物细胞生物反应器及其检测控制系统第七节动物细胞制药的前景和展望1665年英国物理学家虎克Hooke用自制的显微镜发现了细胞实际上是死细胞留下的细胞壁1673年荷兰科学家列文虎克才真正观察到了细胞-细菌1838年德国的植物学家Schleiden 观察到植物细胞1839年动物学家Schwann 观察到动物细胞。??从此认为细胞是一切动植物体结构和功能的基本单元并创立了细胞学说。第一节第一节概概述述??1885年德国人Roux用生理盐水培养鸡胚组织。??1897年德国生理学者Loeb证明从血液和结缔组织中分离到的细胞可以在血清和血浆中存

活。??1903年Jolly观察到蝾螈细胞可以进行体外分裂。??1907年Harrison 在凹玻片的淋巴液内无菌条件下培养了离体的蛙胚神经组织。将组织或细胞从机体取出在体外模拟机体体内生理条件进行培养使之生存和生长已有近百年历史了。第一节第一节概概述述随着细胞生物学、分子生物学、生物化学和基因工程等一系列学科和技术的发展逐渐形成了细胞工程学。以细胞为单位按人们的意志应用生物学、分子生物学等理论和技术有目的地进行精心操作使细胞的某些遗传特性发生改变从而达到改良或产生新品种的目的以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力从而在离体条件下进行大量培养、增殖并提取出对人类有用的产品。动物细胞药物疫苗、淋巴因子、纤维蛋白溶酶原激活剂、单克隆抗体………细胞工程包括真核细胞的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术细胞融合的理论和技术细胞器特别是细胞核移植的理论和技术染色体改造的理论图际踝蚨参锏睦砺酆图际跸赴罅颗嘌睦砺酆图际跻约敖泄夭锾崛〈炕睦砺酆图际酢细胞膜:由一层生物膜组成是细胞与周围环境的分隔。是物质进出细胞的通道。是胞外信号传递的通道。??细胞核:

由两层生物膜围成。遗传信息染色质DNA蛋白质贮存其中。是DNA复制和RNA合成的场所。??线粒体:由两层生物膜围成是生物氧化产生能量的场所。??核糖体:由多条RNA 链与肽链形成的大颗粒参与蛋白质合成。??内质网:由一层生物膜围成参与蛋白质合成修饰与分泌。结合有核糖体的称为粗糙内质网没有核糖体的称为光滑内质网。??高尔基体:由一层生物膜围成参与蛋白质合成修饰与分泌。??溶酶体:由一层生物膜围成是胞内大分子分解的场所。??细胞质:以上各部分统称为细胞器细胞器以外部分称为细胞质细胞质中含有多种蛋白质与酶在代谢和信号传递中起作用。肌肉细胞–纺锤形起到收缩伸展的作用。神经细胞–具有很长的分支很多的纤维以便接受和传递刺激。红细胞–圆盘状使与外界的接触面相对地增大有利于和周围环境交换气体和在血管内流动。上皮细胞–由于它要覆盖于表面常常相互挤压成不规则的立方形、锤形。这些分化的形态当细胞离体培养时经常会发生变化。细胞分化离体培养的细胞贴壁依赖型anchorage-dependent简称贴壁细胞贴壁非依赖型anchorage-independent简称悬浮细胞1 贴壁细胞生长时必须要有给以贴附的支持物表面细胞依靠自身分诘幕蚺嘌

刑峁?奶揭蜃硬拍茉诟帽砻嫔仙ず头敝诚赴诒砻嫔仙な庇辛街中翁上宋赴秃蜕掀ぱ赴汀成纤维样细胞型主要来源于中胚层组织的细胞如心肌细胞、平滑肌细胞与成骨细胞等。??上皮样细胞型主要来源于外胚层和内胚层组织细胞如皮肤细胞、肠管上皮细胞。在培养过程中随着培养条件的变化细胞形态也会发生改变。2、悬浮

细胞生长不依赖支持物表面在培养液中悬浮生长如淋巴细胞等。3、兼性贴壁细胞根据生长条件的不同可贴壁也可悬浮生长中国地鼠卵巢细胞。

1.动物细胞的化学组成无机成分水–约占细胞鲜重的85无机盐–1 1.5有机成分–蛋白质–最重要的化学成份之一细胞生命活动的基础主要20种AA来组成糖类–细胞的主要能源同时细胞的结构组成单糖-五碳糖–核糖是核酸和核苷酸的组成部分六碳糖–主要是葡萄糖细胞能量代谢多糖–食物贮存的多糖–约30000个Glu构成结构多糖–糖蛋白脂质–维持细胞的结构物质的透膜运输和能量的贮存等甘油脂–能源的贮存形式氧化时比糖或蛋白质2倍的能量磷脂–细胞膜主要成分透膜运输相关。脑磷脂、卵磷脂核酸–细胞遗传和代谢方面起着重要的作用也是生命的主要物质基础之一。2动物细胞的代谢糖代谢、脂肪代谢、蛋白质代谢分三个阶段第一阶段–大分子降解为小分子糖–己糖脂肪–甘油、脂肪酸蛋白质–氨基酸第二阶段–小分子进一步代谢产生三个主要的中间产物乙酰辅酶A、α-酮戊二酸、草酰乙酸第三阶段–三羧酸循环–提供能量氧供应充足时–1个葡萄糖可产生36-38个ATP氧供应不足时–通过酵解途径只能产生2个ATP三、动物细胞生理特点三、动物细胞生理特点1、分裂期长12-48小时同一种属不同部位的细胞也不相同分裂期受培养条件的影响如温度、酸度、成分等。2、细胞生长需贴附于基质并有接触抑制现象。大多数二倍体细胞的生长都需在一定的基质上贴附伸展后才能生长繁殖机制并不清楚当细胞在基质上分裂增殖逐渐汇合成片时即细胞与周围细胞接触时细胞就停止增殖—接触抑制若细胞转化成异倍体后该抑制可解除。3、正常二倍体细胞的寿命是有限的正常二倍体细胞传代培养都是有限的大约在50代左右然后细胞就会逐渐死亡但在培养基中加入表皮生长因子或经自然和人为的因素转为异

倍体后该细胞可转变成无限细胞系更适合于工业生产。4、动物细胞对周围环境十分敏感物理化学因素如渗透压、酸度、离子浓度、剪切力、微量元素等的变化都会影响其生长这是由于动物细胞没有细胞壁的保护所以更敏感。5、动物细胞对培养基要求很高动物细胞不仅需要12种必需氨基酸、8种以上维生素多种无机盐和微量元素、葡萄糖外还需要多种细胞生长因子和贴壁因子。6、动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同动物细胞蛋白质的合成在游离和粗面型内质网上都可以进行内质网上合成的蛋白质多数为糖蛋白需要糖基化而细菌细胞则没有糖基化过程。??动物细胞作为宿主细胞生产药物的缺点培养条件要求高、成本高、产量低??优点多半可分泌到细胞外提取纯化方便蛋白质经糖基化修饰后与天然产物更一致适合于临床应用。最初要求生产用动物细胞必须是原代细胞以后放宽至二倍体细胞即可即使是经过多次传代也可用但是非二倍体细胞是绝对禁止使用的因为担心异倍体细胞的核酸会影响到人的正常染色体有致癌的危险由于二倍体细胞传代不会超过50代所以使用受到限制。后来发现异倍体也可使用并未对机体产生影响并且可无限使用对工业生产带来了极大的方便。第三节第三节生产用动物细胞的要求和获得生产用动物细胞的要求和获得原代细胞、已建立的二倍体细胞系、可无限传代的转化细胞系以及用这些细胞进行融合和重组的工程细胞系。1、原代细胞直接取自动物组织、器官经过粉碎、消化后获得的细胞悬液。需大量动物费钱费劳力。一般

1g组织约有109个细胞。2、二倍体细胞原代细胞经过传代、筛选和克隆从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。特点二倍体有明显的贴壁和接触抑制特性有限的增殖能力无致瘤性。3、转化细胞系通过转化形成变成了异倍体有无限增殖能力。转化可自发在传代过程中自己转变成可无限增殖的细胞也可人为转化采用某些试剂处理或从动物的肿瘤组织中建立的细胞系。优点无限传代、倍增时间短、对培养条件和生长因子的要求低适合于大规模工业化生产。4、融合细