TIL细胞分离技术

TIL细胞分离培养

1.收集临床胸腹水

2.离心，弃上清

3.用生理盐水重悬

4.不连续密度梯度分离，下层为100%淋分，中层为75%的淋分，上层为细胞

悬液20ml，3层液面保持分界清晰

5.离心，在两层不同密度的淋分上均有一层细胞，收集TIL细胞

6.TIL细胞培养液为1640（GT-T551）+AB血清+CD3单抗+IL-2

7.视培养情况进行扩增，TIL细胞增液同CIK扩增液

8.培养结束前取样检菌

9.在下次抽胸水时收集TIL细胞回输

09_Trima_Accel全自动血细胞分离机使用操作规程

发放号： 1. 目的：规范单采血小板采集程序，保护血细胞分离机的性能，保障献血者的健康，确保血液质量。 2. 职责：操作人员负责单采血小板的采集和对献血者单采全过程的监护。 3. 适用范围：适用于血小板单采过程。 4. 工作程序： 4.1分离机准备： 4.1.1接通电源，打开设备开关，设备启动并自检。 4.1.2在Trima献血者信息/装载系统主屏幕上，触按"献血者信息”按钮，进入献血者信息屏幕，根据界面信息提示，分别输入献血者的性别、身高、体重并触按“确认信息”确认，进入下界面。 4.1.3根据界面提示，分别输入献血者的血型、血比积、血小板计数值，按“确认信息”确认。触按“确认信息”，进入程序选择界面。 4.1.4根据预期产品量选择最优收集程序，触按“确认程序” 。 4.2装载耗材： 4.2.1触按“装载系统”，根据界面提示，悬挂空袋，插入卡匣，装载环形血道，关闭离心机门顺序装载管路。 4.2.2触按“继续”按钮，系统自动放低卡匣，装载所有的泵、阀门以及传感器。 4.2.3根据界面提示，关闭采血管路以及样品袋管路上的白色夹子，触按“继续”按钮。 4.3初始化： 4.3.1根据界面提示，将ACD抗凝剂袋连接到抗凝管路上。挤压滴液室，使滴液室灌注到刻度线位置。上下拉动抗凝管，使抗凝管道卡入抗凝传感器内，注意滴液室应在传感器下方。 4.3.2触按“继续”按钮，自动进行管路ACD抗凝剂灌注。 4.3.3灌注结束后，界面提示“开始献血者准备”后，开始进行献血者准备。 4.4嘱咐献血者找到舒适位置平躺于采血床上，伸展双臂。 4.5采血针管排空后，按《采血操作规程》选择合适静脉进行穿刺，确定采血针在静脉内后用胶带纸加以固定，打开滑轮夹。 4.6采集： 4.6.1触按“开始抽取按钮”，进行收集产品。 4.6.2收集完成时，系统将发出“哗哗”的提示音，自动进入回输过程，回输完成，仪器会发出嘟嘟的提示音，系统状态行显示“运行完成”的消息。 4.7触按“继续”按钮。系统提示您密封及去除所有的产品袋以及AC袋。关闭进血管路上的白

膜分离技术在处理废水中的应用

说明本表需在指导教师和有关领导审查批准的情况下，要求学生认真填写。说明课题的来源（自拟题目或指导教师承担的科研任务）、课题研究的目的和意义、课题在国内外研究现状和发展趋势。若课题因故变动时，应向指导教师提出申请，提交题目变动论证报告。

用前景。目前，膜的发展缓慢的原因有：膜产品的价格昂贵；膜污染较严重；膜分离性能低下。对于以上的三个问题可以更好的解决的话，膜分离技术发展会突飞猛进，跨越时代的进步，可以快速提高经济效益，对于水资源的利用率更高，会发挥更为重要的作用。参考文献： [1]彭会清, 庞翠玲. 膜分离技术在处理酸性废液中的应用概述[J]. 金属矿山, 2006(9):14-17. [2]韩倩倩. 膜分离技术在水处理中的应用现状及展望综述[J]. 硅谷, 2009(9):117+133. [3]朱智清. 膜分离技术的发展及其工业应用[J]. 化工技术与开发, 2003, 32(1):19-21. [4]岳志新, 马东祝, 赵丽娜,等. 膜分离技术的应用及发展趋势[J]. 云南地理环境研究, 2006, 18(5):52-57. [5]张杰, 褚良银, 陈文梅. 膜分离技术在废水处理中的应用[J]. 过滤与分离, 2004, 14(3):8-11. [6]谷大建, 徐巍. 膜分离技术的应用及研究进展[J]. 中国药业, 2008, 17(6):58-59. [7]陈翠萍, 谌伟艳. 膜分离技术及其在废水处理中的应用[J]. 污染防治技術, 2007, 20(3):42-45. [8]吴绮桃. 膜分离技术及其在水处理中的应用[J]. 四川建材, 2008, 34(2):58-59. [9]郭洪勋. 膜分离技术的研究进展[J]. 科技创业家, 2012(8). [10]孙佳林, 何晓燕. 膜分离技术处理印染废水在我国的应用及发展趋势[J]. 化工管理, 2014(3):92-93. [11]段巧丽, 宁艳春. 现代膜分离技术的应用研究与进展[J]. 管理学家, 2011. [12]孙文毅, 张斌. 膜分离技术在水处理中的应用[J]. 北京电力高等专科学校学报:社会科学版, 2010, 27. [13]陈业刚. 膜分离技术在水资源回用领域的应用研究[J]. 中美国际过滤与分离技术研讨会, 2010. [14]李晓波, 王晓静. 膜分离技术及其在废水处理中的应用[J]. 河北工业科技, 2005, 22(4):207-211. [15]刘济阳, 夏明芳, 张林生,等. 膜分离技术处理电镀废水的研究及应用前景[J]. 污染防治技术, 2009, 22(3):65-69.

白细胞分离技术汇总

外周血白细胞的分离：（细胞分离液有市售，有各种型号：白细胞、单核细胞淋巴细胞等分离液） 1> 取3ml正常人的外周血（枸橼酸钠抗凝）与等体积pbs混匀后小心的加于6ml白细胞分离液液面上，1500r/min离心20 min。（或先将抗凝血离心，然后吸取中间白细胞层，再混以等体积pbs然后小心加于等体积细胞分离液液面上，离心同上） 2> 吸取中间云雾状白细胞，加3－4mlPBS后3000 r/min离心10 min。 3> 弃上清，加1ml PBS洗涤沉淀后，将细胞悬液转移至1.5mLEp 管中。 4> 3000r/min离心20 min，弃上清。即得白细胞可以试试红细胞裂解液提供我的配方：氯化铵82.9克；重碳酸钾10.0克；EDTA0.37克；用三蒸水配成1升所有的细胞培养都应该坚守无菌操作原则 2.分层后的确有3层，准确说来是4层，最下面是红细胞，上面的一层不应该是稍微混浊的白色，应该也比较透明，这一层上面就是我们需要的薄细胞层，最上面是血清 3.细节： a.淋巴细胞分离液要避光保存 b.就您的试验看来，淋巴细胞分离液的问题可能是最主要的 c.首先再离心管中加入淋巴细胞分离液，然后把标本缓慢加在淋巴细胞分离液表面上，一定要缓慢小心操作，切不可混匀 d.所有操作都应在无菌环境进行 e.把离心管放入离心机是也应小心，不要太大幅度的摇幌离心管，当然离心后拿出来也要小心就这么多了吧，这个操作是不是很难的，比较基本祝您好运了！

.参考方法：人外周血, 肝素抗凝(100U ?m l) , 等量无血清培养液（或者PBS等缓冲液）稀释。按1∶2 的体积比缓置于比重1. 077 g/m l 的淋巴细胞分离液, 1000 ×g 离心 30 m in, 收集培养液2分离液界面上的单个核细胞。于无血清培养液, 400×g 离心10 m in, 洗涤2次。用培养液重新悬浮细胞并计数我也是最近要做所以查了一下，仅供分享，呵呵！一外周血白细胞的分离 1> 取3ml正常人的外周血（枸橼酸钠抗凝）与等体积pbs混匀后小心的加于6ml白细胞分离液（（33.9%泛影葡胺和9%Ficoll液按1：2.4体积比混合））液面上，1500r/min离心20 min。（或先将抗凝血离心，然后吸取中间白细胞层，再混以等体积pbs然后小心加于等体积细胞分离液液面上，离心同上） 2> 吸取中间云雾状白细胞，加3－4mlPBS后3000 r/min离心10 min。 3> 弃上清，加1ml PBS洗涤沉淀后，将细胞悬液转移至1.5mLEp管中。 4> 3000r/min离心20 min，弃上清。即得白细胞二自然沉降法本法是利用血細胞自然沉降率的分離法，採集血液後應及時抗凝，通常選用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原轉化為凝血酶，從而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白而防止血液凝固。操作原則是將含抗凝血的試管直立靜置室溫30～60min後，血液分成明顯三層，上層為淡黃色血漿，底層為紅細胞，緊貼紅細胞層上面的灰白層為白細胞，輕輕吸取即得富含白細胞的細胞群，離心洗滌後加入少量蒸餾水或含氯化銨的Gey溶液，經短時間的低滲處理，使紅細胞裂解，經過反復洗滌可得純度較高的白細胞懸液。

血细胞分离技术

血浆置换(plasma exchange, PE，即血浆单采术)是一种特殊的体外血液净化技术，利用血浆分离器或离心的方法将患者的血浆与血细胞分离，弃掉含有致病物质的血浆，并同时补充等量的置换液，从而达到治疗疾病的目的。血浆置换比药物治疗更快、更有效地去除致病因子，为原发病的治疗创造了有力条件。血浆置换可以去除血浆中的致病的大分子物质，如：免疫球蛋白、免疫复合物、抗体、类风湿因子、内毒素及炎性介质、胆红素、LDL、病毒等。血浆置换的治疗模式 1.单重血浆置换：血浆分离器分离患者的血浆和血细胞，弃掉含有含有致病因子的全部血浆，然后补充相同体积新鲜冰冻血浆（FFP）或白蛋白溶液。目前还有两种更高级的方法可以选择性地去除血浆有害物质，而保留其他的有益物质。 2.二次膜式分离（double filtration plasmapheresis,DFPP）

首先是用一级血浆分离器分离患者的血浆和血细胞，然后再用孔径较小的二级滤器分离出大分子致病物质（如：球蛋白和免疫复合物），而保留宝贵的白蛋白等中分子物质。 3.血浆吸附（plasma adsorption,PA）血浆分离器分离患者的血浆和血细胞，然后血浆再经过吸附柱，选择性地去除有害物质分。血浆置换的临床应用目前血浆置换可应用于临床上多种疾病，具体如下： 1.肾脏风湿疾病：

抗肾小球基底膜病（抗GBM病）、血栓性血小板减少性紫癜、冷球蛋白血症、ANCA相关性小血管炎、肾移植后超急性或急性抗体介导的排异反应、肾移植后FSGS复发、噻氯匹定/氯吡格雷相关的血栓性微血管病、SLE及狼疮性肾炎、类风湿关节炎，溶血性尿毒症综合征等。 2.脓毒血症和多器官功能障碍综合征 3.神经系统疾病：格林-巴利综合征、重症肌无力、慢性炎性脱髓鞘多发性神经病、儿童自身免疫性神经精神障碍合并链球菌感染、IgG/IgA相关脱髓鞘多发性神经病，急性播散性脑脊髓膜炎、多发性硬化。 4.代谢性疾病：家族性高胆固醇血症、甲亢危象、淀粉样变性。 5.血液系统疾病：纯红细胞再生障碍性贫血，自身免疫性溶血性贫血，多发性骨髓瘤，血友病。 6.结缔组织病：（灾难性）抗磷脂抗体综合征、重症系统性红斑狼疮。 7.皮肤疾病：重型药疹、天疱疮、类天疱疮、重症银屑病、妊娠疱疹、迟发性皮肤卟啉病等。 8.药物、毒物中毒性疾病：三环类药物、地高辛、茶碱、维拉帕米、地尔硫卓、毒蘑菇、对硫磷中毒，原因不明的“致死性”中毒等 9.其他疾病：

人外周血单核细胞分离技术

人外周血单核细胞分离 1.抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血 A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min 离心20 min，吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约10?12.5 mL 。 2.沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀 A中的细胞中加入Hank s液（不含Ca2+、Mg 2+, pH 7.2 ?7.6）体积比仍未1:1 , 混匀，制成细胞悬液。 B:无菌抗凝血与Hank s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。此时稀释后的细胞悬液分离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜 3.单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的 2 / 3。混匀后离心1500r/mi n 离心 10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。第二种方法，比较简单一些。再用同样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min 离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。按每毫升血液标本加0.2 mL含20%小牛血清的Hank s液（或含10%胎牛血清及25 mmol /L hepas的RPMI-1640 液3?4 mL）重新混悬细胞37 C、5% C02孵育箱中培养2?3 h 后去除上清，得到贴壁的单核细胞。于各培瓶中分别加入含10%胎牛血清的RPMI-1640

免疫细胞的分离和保存技术

免疫细胞的分离和保存技术用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。一、白细胞的分离（一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。（二）聚合物加速沉淀法本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。二、外周血单个核细胞的分离外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为 1.075～1.090，血小板为 1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的

膜分离技术及其原理的介绍

人们对膜进行科学研究是近几十年来的事。反渗透膜是膜分离技术发展中是一个重要的突破，使膜分离技术进入了大规模工业化应用的时代。其发展的历史大致为：20世纪30年代微孔过滤;40年代透析;50年代电渗析;60年代反渗透;70年代超滤和液膜;80年代气体分离;90年代渗透汽化。此外，以膜为基础的其它新型分离过程，以及膜分离与其它分离过程结合的集成过程也日益得到重视和发展。一、膜分离原理膜分离过程是以选择性透过膜为分离介质，当膜两侧存在某种推动力(如压力差、浓度差、电位差、温度差等)时，原料侧组分选择性地透过膜，以达到分离、提纯的目的。不同的膜过程使用不同的膜，推动力也不同。目前已经工业化应用的膜分离过程有微滤(MF)、超滤(UF)、反渗透(RO)、渗析(D)、电渗析(ED)、气体分离(GS)、渗透汽化(PV)、乳化液膜(ELM)等。二、膜分离技术反渗透、超滤、微滤、电渗析这四大过程在技术上已经相当成熟，已有大规模的工业应用，形成了相当规模的产业，有许多商品化的产品可供不同用途使用。这里主要以反渗透膜和超滤膜为代表介绍一下。反渗透膜(RO)

反渗透膜使用的材料，最初是醋酸纤维素(CA)，1966年开发出聚酰胺膜，后来又开发出各种各样的合成复合膜。CA膜耐氯性强，但抗菌性较差。合成复合膜具有较高的透水性和有机物截留性能，但对次氯酸等酸性物质抗性较弱。这两种材料耐热性较差，高温度大约是60℃左右，这使其在食品加工领域的应用中受到限制。超滤膜(UF) 超滤膜也是使用CA做材料，后来各种合成高分子材料得以广泛应用。其材料多种多样，共同特点是具有耐热、耐酸碱、耐生物腐蚀等优点。以上就是为大家介绍的全部内容，希望对大家有帮助。

细胞培养的基本方法-细胞分离技术

细胞培养的基本方法-细胞分离技术细胞分离技术一、从原代组织中分离细胞将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短, 以保持最大的活性。下列步骤可以解聚整个组织，获得较高产量的有活性细胞。 1. 胰蛋白酶（Trypsin） ?在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mn小片，通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次。 ?将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。加入0.25 %溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml胰蛋白酶）。 ?在4C孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。 ?移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37C孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。 ?在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。 ?通过无菌不锈钢丝网（100?200mm过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。 2. 胶原酶（Collagenase） ?用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm」、片，用Hanks'平衡液（HBSS清洗组织碎片几次。 ?加入胶原酶（50?200单位/ml，溶解在HBSS中）。 ?在37C孵育4到18小时。加入3mM CaCI2增加解离效率。 ?通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。 ?通过离心在HBSS中清洗悬液几次。 ?再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。 3. Dis pase ?用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mn小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。 ?加入Dispase （0.6?2.4单位/ml溶解在无钙镁的平衡盐溶液） ?在37C孵育20分钟到几个小时。 ?通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的

原代细胞培养之--细胞分离技术

原代细胞培养之－－细胞分离技术原代细胞的分离和制作人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：一、悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。二、实体组织材料的分离方法对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。（一）机械分散法所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。（二）消化分离法组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。 1、酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：（1）胰蛋白酶分散技术

人外周血单核细胞分离技术

人外周血单核细胞分离 1. 抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血 A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min离心20 min，吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约10～12.5 mL。 2. 沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀 A 中的细胞中加入Hank′s液( 不含Ca2+、Mg2+, pH 7.2 ～7.6) 体积比仍未1:1，混匀，制成细胞悬液。 B: 无菌抗凝血与Hank′s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。此时稀释后的细胞悬液分离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜 3. 单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的2／3。混匀后离心1500r/min离心 10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。

注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。第二种方法，比较简单一些。再用同样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。按每毫升血液标本加0.2 mL含20%小牛血清的Hank′s液( 或含10%胎牛血清及25 mmol /L hepas的RPMI-1640液3～4 mL) 重新混悬细胞37℃、5% CO2孵育箱中培养2 ～3 h 后去除上清，得到贴壁的单核细胞。于各培瓶中分别加入含10%胎牛血清的RPMI-1640液3～4 mL，按需调定细胞密度, 于37℃、5% CO2孵育箱中培养备用。 4. 单核细胞的纯度与细胞活力的鉴定取一定体积的细胞悬液送做流式细胞CD14、CD56 等检查,以测定所得细胞的纯度。取1 滴细胞悬液置于血细胞计数板内计数。以台盼蓝拒染法检测细胞活力。取1滴细胞悬液加1 滴2%台盼蓝染液混匀，加盖片，显微镜高倍镜检，活细胞不着色，折光强；死细胞被染成蓝色，体积略膨大。

关于购置血细胞分离机的社会效益和经济效益分析

关于购入血细胞分离机的社会效益和经济效益分析院领导，采购处：卫生部2009年第18号文件刚刚下达，要求第三类医疗技术由卫生部准入，5月1日开始执行。已经开展该项工作并具备相应科室的医院只须申请评审即可，尚未开展的医院则需要申请开展。因为我院已开展该项治疗14例，对我院十分有利。因而尽快完善设施、设备、人员条件，并通过卫生部评审注册，将奠定我院在该领域的学术地位。上报卫生厅申请成立河北省肿瘤生物治疗中心的报告已得到答复，即待卫生部评审注册后，省厅才可以审批成立中心的有关事宜。目前，病房准备已完成，独立核算号已申请，聘用临时工人员即将到位。目前面临的问题有两个，一是医生编制问题，二是血细胞分离机到位时间问题。一旦以上两个问题得到解决，马上可以开诊。关于设备购入的理由和效益分析如下：1、购入血细胞分离机的理由：购入血细胞分离机，是提高疗效，提高治疗规模，降低消耗的必要条件。该项目需要采取病人外周血单个核细胞，以往应用CS3000机型的经验和教训是：因为CS3000机型的技术参数是，红细胞污染率为≤5%，所采取的细胞中混入过多的红细胞和血小板，因而不得不进行多次洗涤和大量细胞因子扩增以达到效应细胞的数量要求，因而工作量极大，效率却很低，效应细胞的制备成本高（细胞因子价格很高），细胞数量不足，同时降低了疗效。而COBE Spectra机型参数是，红细胞污染率<1%，而且能够随时观察细胞分离状态并可加以调控，因而大大提高了细胞的纯度，降低了工作量，节省了时间，细胞因子用量减少而降低了成本，更重要的是疗效得以保证。 2、社会效益：肿瘤生物治疗目前已被国际、国内普遍认为是继手术、化疗、放疗之后的第四大肿瘤治疗模式。国外已进入III期临床，国内各大型医院如北京协和、301、肿瘤医院、沈阳军区总院、南京军区总院、广州南方医院、上海瑞金医院、青岛医学院附属医院、天津肿瘤医院等。收治病人量从每年200例到1500例不等。肿瘤生物治疗项目的临床应用创造了极大的社会效益。主要表现在：①早、中期肿瘤病人根治术后可防治肿瘤复发，改善病人生存质量，提高生存率。②晚期肿

血细胞分离技术

第十八章血细胞分离技术（Separation technique of the blood cell）一、原理在体外进行细胞免疫检测时，首先必须进行淋巴细胞的分离。分离淋巴细胞的方法很多，但不管采用哪种方法，均要求分离的淋巴细胞纯度高、产量多，而且不丧失活性，同时也要求分离技术简单、操作方便。外周血液中红细胞和白细胞的比例在几百甚至上千比一，两类细胞的大小和密度不同，其沉降速度也就不同。红细胞的自然沉降率较快，加入高分子量的聚合物，如明胶、右旋糖酐等还可以加速其凝聚。利用自然沉降法、密度梯度离心法或二者结合，可以将淋巴细胞从血液中分离出来。这种分离出的淋巴细胞一般包括单核细胞。除去单核细胞，可以利用单核细胞的吸附功能，如铁颗粒、玻璃面或尼龙网等，除去（或分离）单核细胞，从而提纯淋巴细胞。二、采血（一）材料与试剂 1．抗凝剂（1）肝素：肝素是含硫酸基的粘多糖，常用其钠盐或钾盐，它能阻止凝血酶原转化为凝血酶，进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白，从而阻止血液凝固。常用的肝素溶液浓度为1 000U/ml，市售肝素多为100U~126U／mg。（2）乙二胺四乙酸（EDTA）：是一种螯合剂。用生理盐水配制成4％的溶液备用。 · 1 ·

（3）阿氏液（Alsever液），配方如下：枸橼酸钠（Na3C6H5O7·5H2O）0.80g 枸橼酸0.0325g 葡萄糖 2.05g 氯化钠0.42g H2O 加至100.00ml 混匀溶解后，114.3℃高压蒸汽灭菌10min备用。阿氏液中既含有枸橼酸钠抗凝剂，又含有细胞生存的营养，所以它既可做抗凝剂，又可做血细胞的保存液。 2．针头根据不同动物和采血部位，采用不同型号的针头，用前必须灭菌或消毒。 3．采血容器注射器或三角瓶等。 4．采血动物。（二）操作方法 1．采血法各种动物采血方法不一。马、牛、羊等大动物一般从颈静脉采血，猪从颈静脉、前腔静脉或耳静脉采血，家禽由翼下静脉或心脏采血，兔由心脏或耳静脉采血，犬由颈静脉或四肢静脉采血，豚鼠由心脏采血，小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血。 2．抗凝采集血液最关键的问题是抗凝，采用什么方法进行抗凝，则根据实验的要求和条件而定。最常用的方法如下：（1）肝素抗凝：采血时，使每ml血液含15U~20U肝素即可。计算采集的血液量，按1 000U/ml的量加入肝素，直接放入采血容器中，采血时，边采血边轻轻摇动，使抗凝剂和血液混匀。对于采少量的血液或小动物采血，可直接用注射器抽取一定量的肝素液，再采血直接抗凝。（2）EDTA抗凝：采血前，用灭菌生理盐水将EDTA配制成4％溶液，然后按预采血液的量，以每ml血液加入1mg~2mg的EDTA的液体量于采血容器内。采血，并不断摇动采血容器，使之混匀。（3）玻璃珠法：预先将适量的玻璃珠（根据采血量多少而定）清洗后，装入采血容器中，灭菌后备用。采血过程中，边采边摇采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滚动，以机械地除去纤维蛋白，使血液不能凝固。本法虽较麻烦，但对淋巴细胞的活性影响最小，且可减少血小板的混杂。（4）阿氏液采血：以阿氏液和采血量以1︰1比例采集血液，边采边轻轻摇动采血瓶，使之混匀。用阿氏液采血，除了抗凝外，多用于红细胞的保存。一般在4℃ 条件下，阿氏液中保存的红细胞2周其活性和特性不变。 · 2 ·

细胞分离常用方法

细胞分离常用方法一、悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的TD4A低速离心机离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。二、实体组织材料的细胞分离方法对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。 (一)机械分散法所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。 (二)消化分离法组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状)，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。 1、酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下： (1)胰蛋白酶分散技术胰蛋白酶(简称胰酶)是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开，在常用的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。 ①细胞类型胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效，但若与胶原酶合用,就能增加其对组织的分离作用。 ②酶的活力市售的胰蛋白酶,其活力都经过测定而有效，但配制时必须新鲜，需保存在低温冰箱中，消化时的pH 和温度都要适宜，否则会影响活力，细胞的分散直接与酶的活力有关，最终使用活力为1:200或1:250，56℃pH8.0时活力最强。该酶为粉剂，保藏时要防潮，室内温度不宜过高，保存时间不能太长，若粉剂结团块,说明该部分受潮或失效。 ③酶的浓度胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但遇到难消化的组织时，浓度可适当提高，消化时间适当延长。浓度高对细胞有毒性，而较低浓度的胰蛋白酶在培养液中可促进细胞的增殖，若培养液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。 ④温度一般认为胰蛋白酶在56℃时活性最强，但由于对细胞有损害而不能被采用，常使用的温度为37℃，通常在37℃进行消化比室温作用快。

原代肝细胞分离方法

原代肝细胞分离方法体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞. 自1953年Anderson[2]首创剪切法从肝脏分离肝细胞以来, 各实验室对肝细胞的分离方法进行了不断改进. 在众多方法中, 主要分为非灌流的方法和灌流的方法. 1.1 采用非灌流的方法早期的研究一般通过非灌流这种简单的步骤分离肝细胞. 1.1.1 机械分离法: 机械分离法是利用机械剪切及强力吹打等物理手段来分离肝细胞的方法[3]. 张顶et al[4]在分离树鼩肝细胞的过程中, 首先将树鼩的肝脏剪成小块, 然后通过挤压、剪碎和震荡等机械手段, 使肝细胞从肝组织上脱落, 从而获得互相分离的肝细胞. 1.1.2 胰酶消化法: 胰酶消化法是利用胰酶来破坏肝细胞之间的桥连, 使肝细胞分离的一种方法. Dulbecco et al[5]首次采用胰酶来分离猴肾细胞、大鼠肝细胞, 并运用到体外细胞的研究和培养中. 刘友平et al[6]利用该方法分离肝细胞时, 首先取出小鼠的肝组织用眼科剪剪碎至糊状, 然后用缓冲液充分清洗并加入胰酶进行消化. 待消化完全后用D-Hank's液清洗, 最后加入含有血清的培养液终止胰酶的作用, 得到消化彻底的细胞悬液. 1.1.3 胶原酶消化法: 胶原酶消化法是利用胶原酶来破坏细胞间的纤维成分, 使肝细胞分离的一种方法. 王琳et al[7]在利用该方法分离新生小鼠肝细胞时, 首先将新生小鼠的肝脏剪成1 mm3组织块, 用无钙无镁的D-Hank's液反复冲洗后加入胶原酶进行消化. 最后用DMEM液终止胶原酶的作用, 得到肝细胞悬液. 1.2 采用灌流的方法虽然非灌流的方法以其简单易行的特点得到了一定的应用, 但由于存在消化不完全、分离得到的肝细胞中多细胞团块存在的问题, 不能满足许多基础研究或临床应用的要求. 1969年, Berry和Friend[8]引入了肝脏灌流法, 灌流可以使消化液与肝组织更加充分地接触, 不仅提高了分离效率, 还使分离所得肝细胞的活力和数量大大提高. 1.2.1 离体胶原酶灌流法: 离体胶原酶灌流法是将离体灌注与胶原酶消化相结合的方法. 在使用该方法分离肝细胞时, 首先将动物肝脏取出, 于门静脉内置管或直接在获得的肝组织块的血管或切口内置管, 用预热的无钙无镁的D-Hank's液灌流. 然后换用胶原酶作持续灌流, 使肝细胞与间质分离. 最后用培养液终止胶原酶的消化作用, 过滤、离心、弃上清后得到肝细胞悬液. 1.2.2 Seglen两步灌流法（原位胶原酶灌注法）: 自从引入灌流法分离肝细胞以来, 许多学者根据不同的应用条件对灌流法进行了改良. 其中Seglen[10]经过一系列细致的研究, 创立了改良的Seglen两步灌流法, 这一方法已成为应用至今的标准的原代肝细胞分离方法. 两步灌流法主要是通过门静脉先后用含EDTA或EGTA缓冲液和胶原酶缓冲液进行灌注来分离肝细胞的方法. 许多学者在具体操作中, 不断改进两步灌流法的灌注条件, 目的在于进一步减少分离过程中肝细胞的损伤, 提高肝细胞的活率. 1.2.3 半原位胶原酶灌流法:

T细胞分离

T淋巴细胞分离技术免疫细胞的分离、纯化和鉴定第一节免疫细胞的分离、纯化技术各种免疫细胞的分工与协作，共同完成免疫应答及其调控，因此，各种免疫细胞的分离及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。免疫细胞分离的方法有很多，主要是根据细胞的理化性状、功能，以及细胞表面标志等的差异而设计的。粘附分离法、尼龙毛柱分离法、羰基铁分离法等主要根据细胞的属性（如粘附）和功能不同，旨在将粘附和非粘附或粘附力较小的细胞分离开。有人证实免疫细胞在玻璃或塑料平面上的粘附能力分别为：巨噬细胞或单核细胞〉树突状细胞二抗体产生细胞〉B淋巴细胞〉T淋巴细胞二红细胞。粘附的细胞可通过trypsin洗脱而收集。葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法和Percoll不连续密度梯度离心法等是根据细胞的大小及比重的差异进行细胞分离。 E花环沉淀分离技术主要是利用细胞表面标志进行细胞分离。尚可利用特异性单克隆抗体结合其它技术分选细胞，如补体细胞毒分离法，洗淘分离法（panning）、流式细胞术分离法，以及免疫磁珠法分离细胞技术等。一般应根据实验的目的及所需细胞的种类、纯度及数量等要求来确定采用何种方法。实验一Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC 外周血单个核细胞（Peripheralbloodmonuclearcell,PBMC的分离是免疫学研究中的一项基本技术。目前国内外分离PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法 (ficoll-hypaquedensitygradientcentrifugation )，用此方法分离PBMC纯度可达95%，淋巴细胞约占90%，其中T淋巴细胞占80%, B淋巴细胞占4?10%。 ficoll-hypaque混合溶液，又称淋巴细胞分层液，在分离人PBMC时，要求

09_Trima_Accel全自动血细胞分离机使用操作规程

1. 目的：规范单采血小板采集程序，保护血细胞分离机的性能，保障献血者的健康，确保血液质量。 2. 职责：操作人员负责单采血小板的采集和对献血者单采全过程的监护。 3. 适用范围：适用于血小板单采过程。 4. 工作程序： 4.1 分离机准备： 4.1.1 接通电源，打开设备开关，设备启动并自检。 4.1.2 在Trima献血者信息/装载系统主屏幕上，触按“献血者信息”按钮，进入献血者信息屏幕，根据界面信息提示，分别输入献血者的性别、身高、体重并触按“确认信息”确认，进入下界面。 4.1.3 根据界面提示，分别输入献血者的血型、血比积、血小板计数值，按“确认信息”确认。触按“确认信息”，进入程序选择界面。 4.1.4 根据预期产品量选择最优收集程序，触按“确认程序”。 4.2 装载耗材： 4.2.1 触按“装载系统”，根据界面提示，悬挂空袋，插入卡匣，装载环形血道，关闭离心机门顺序装载管路。 4.2.2 触按“继续”按钮，系统自动放低卡匣，装载所有的泵、阀门以及传感器。 4.2.3 根据界面提示，关闭采血管路以及样品袋管路上的白色夹子，触按“继续”按钮。 4.3 初始化： 4.3.1 根据界面提示，将ACD抗凝剂袋连接到抗凝管路上。挤压滴液室，使滴液室灌注到刻度线位置。上下拉动抗凝管，使抗凝管道卡入抗凝传感器内，注意滴液室应在传感器下方。 4.3.2 触按“继续”按钮，自动进行管路ACD抗凝剂灌注。 4.3.3 灌注结束后，界面提示“开始献血者准备”后，开始进行献血者准备。 4.4 嘱咐献血者找到舒适位置平躺于采血床上，伸展双臂。 4.5 采血针管排空后，按《采血操作规程》选择合适静脉进行穿刺，确定采血针在静脉内后用胶带纸加以固定，打开滑轮夹。 4.6 采集： 4.6.1 触按“开始抽取按钮”，进行收集产品。 4.6.2 收集完成时，系统将发出“哗哗”的提示音，自动进入回输过程，回输完成，仪器会发出嘟嘟的提示音，系统状态行显示“运行完成”的消息。 4.7 触按“继续”按钮。系统提示您密封及去除所有的产品袋以及AC袋。关闭进血管路上的白色夹子，拔出采血针，摇匀后热合、封口并留取标本供质量鉴定使用。触按“继续”按钮。

原代细胞培养与分离

原代细胞的培养与建系凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。原代细胞的取材人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。一、取材的基本要求 .1．取材要注意新鲜和保鲜 .2．应严格无菌 .3．防止机械损伤 .4．去除无用组织和避免干燥 .5．应注意组织类型、分化程度、年龄等 .6．作好记录二、各类组织的取材技术皮肤和粘膜的取材内脏和实体瘤的取材血液细胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材动物组织取材人胚体组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材皮肤和粘膜的取材主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘

米。内脏和实体瘤的取材内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。血液细胞的取材血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。动物组织取材 1、鼠胚组织取材首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。 2、幼鼠胚肾（或肺）取材幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，

细胞分离技术

细胞分离技术一、离心技术离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。一般认为，转速为10~25Kr/min的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min，离心力大于89Kｇ则称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min，离心力超过500Kg。（一）、差速离心（differential centrifugation）在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器（图2-22）。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。图2-22 速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀（二）、密度梯度离心（density gradient centrifugation）用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种（图2-23）。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。

图2-23 A等速度沉降，B等密度沉降 1、速度沉降速度沉降（velocity sedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。 2、等密度沉降等密度沉降（isopycnic sedimentation）适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度，而且介质的梯度要求较高的陡度，不能太平缓。再者，这种方法所需要的力场通常比速率沉降法大10~100倍，故往往需要高速或超速离心，离心时间也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不利。大细胞比小细胞更易受高离心力的损伤，而且停留在等密度介质中的细胞比处在移动中的细胞受到更大的损伤。因此，这种方法适于分离细胞器，而不太适于分离和纯化细胞。二、流式细胞术流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%（图2-24）。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer）。