第四章 细胞破碎和分离提取技术 PPT课件
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eg.动物细胞和革兰氏阴性菌。 • 细胞于高渗介质中？脱水达到平衡后，迅速将其转置于低
渗透压的水或缓冲液中，水进入细胞使胞壁和胞膜破裂
• 2）冻结－融化法（Freezing and Thawing） • 细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，反复操作多次使细胞破
坏，对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较 为有效
• 原理：干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞 Wish株、人喉癌细胞株Hep-2等)产生抗病毒蛋白，从而使 细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)的攻击，根据待测样品不 同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。
• 材料： VSV、Wish细胞、MTT、二甲亚砜(DMSO)、10 ％FCS RPMI1640、培养板、培养瓶、CO2孵箱、超净台、 酶标检测仪。
or molarity of the buffer due to common ion effects
方案2
• Choose the buffer（with a pKa as close as possible to the desired pH） • Indentify whether the buffer is made from an acid or a base（buf
珠磨法、压榨法 高压匀浆、超声破碎、撞击法
非机械法
干燥处理 溶胞作用
1）酶溶法 2）化学法 3）物理法
超临界细胞破碎
1、机械方法破碎
• 1）珠磨法（bead milling） ：细胞悬浮液与极小的研磨剂如玻 璃小珠、石英砂等一起高速搅拌，细胞与研磨剂之间相互 碰撞、剪切，使细胞达到某种程度破碎，释放内含物
• Before the protein can be isolated, it is necessary to conceive of(确定) an activity and to devise（设计） an appropriate assay.
• The activity assay should be: • specific, to define the protein of interest and distinguish it
和蛋白质构成的柔软的细胞膜，易于破碎 • 细菌：革兰氏阳性菌的细胞壁比阴性菌的细胞壁
坚固Why？较难破碎。 • 酵母或其他真菌：胞壁由葡聚糖、甘露聚糖等多
糖和蛋白质构成，比革兰氏阳性菌的胞壁厚
• G+：典型金黄色葡萄球菌，肽聚糖60-95% • G-：典型E.Coli，肽聚糖10% • 不同类型细菌的细胞壁结构成分：
补充2
4.3 Assays for activity and concentration
• Most proteins have some form of unique functional activity （具有一种活性）, which defines the specific protein.
“x”ml solution of A＋ “y”ml solution of B Involves extra work（making up two solutions） 缺点 Waste（The unused volumes of A and B are discarded） Usually inaccurate Why? The presence of extra salts may change the pH
• 破碎原理：利用高压使悬浮液通过针形阀，从阀座与阀之间的 环隙高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击后，急 剧释放到低压环境
• 破碎作用力：突然减压和高速冲撞
• 操作参数少且易于确定，实验 室及工业生产中均可
• 适用于酵母和多数细胞的破碎
• 对易造成堵塞的团状或丝状真 菌及一些易损伤匀浆阀、质地 坚硬的亚细胞器一般不适用 阀座
4、生物法破碎
• 原理：利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到 部分或完全破坏后再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜， 进一步增大胞内产物的通透性
• 优点：产品释放的选择性高、产品破坏少、对温度及 pH等外界条件要求低，不残留细胞碎片等，不同的细 胞壁结构决定了需要不同的酶
•溶菌酶lysozyme适用于G＋的细胞壁，若配合EDTA、TritonX100则可有效作用于G－的胞壁； •真核细胞需用不同的酶：酵母细胞需用葡聚糖酶或甘露聚糖 酶；破坏植物细胞壁需用纤维素酶
方案1
• 磷 酸 盐缓 冲 液 （ 1/15 mol/L， pH7.5 ） ： 600mL 1/15mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4）与400mL 1/15 mol/L磷酸二氢钠（NaH2PO4）混匀。
→1L 1/15 mol/L Na2HPO4 /NaH2PO4缓冲液、pH7.5 buffer A
机械破碎法总结
• 以上几种机械破碎法的作用机理不尽相同，有各自的适用范 围（包括菌体细胞、细胞发酵液的特性）和处理规模（实验 室或工业用）
方法
珠磨
高压匀浆 超声破碎
使用规模
实验室、工业用
实验室、工业用 实验室
适用对象 酵母、藻类及丝状真菌 酵母菌、细菌 细菌
2、细胞物理破碎方法
• 1）渗透压冲击法（osmotic shock） • 最为温和的一类细胞破碎方法，适用于易于破碎的细胞，
撞击环 阀
3）超声波破碎（ultrasonication）
• 机理：高于20kHz的超声作用下产生的空穴化作用，空穴由于 超声波的冲击而产生和闭合，产生极大的冲击波和剪切力。
缺点： A、影响因素多，细胞种类、浓度 和处理时间、探头材料和形状； B、有效能量的利用率低； C、产热大，需控温； D、不易放大，仅应用于实验室规 模的细胞破碎。
描述缓冲液的两个指标：缓冲液的摩尔浓度 缓冲液pH
小结
• 缓冲液的pKa值尽可能接近预期pH（pH±0.5） • 温度改变、溶液稀释及添加中性盐的情况下，缓冲液pH
变化尽可能小 • 缓冲物质不与实验中其他物质发生反应，不干扰实验的检
测（eg.硼酸盐/糖蛋白，280nm处有光吸收）
一般常用的缓冲液都有现成的配方，可查阅相关参考书 利用特定的缓冲液计算软件或者网上缓冲液计算软件： /users/mjfrbn/buffers/makebuf.asp
pH = pKa ± 0.5时，作为buffer，其缓冲能力最强
磷酸盐缓冲体系
For most biochemical purposes, pKa2 is of greatest interest－Why？
How to making a buffer？
• 溶液： • 1/15 mol/L Na2HPO4 /NaH2PO4 、pH7.5缓冲液 • 含1 mmol/L EDTA • 0.15 mol/L NaCl • 2mol/L尿素 • 3mmol/L GSH和0.6mmol/L GSSG • 1L
生化分离工程
第四章 细胞破碎和分离提取技术
破碎缓冲液
• 一般为0.1-0.2mol/L，pH为7－8的磷酸盐缓冲液或Tris缓 冲液（与细胞内环境相似）
抗氧化剂：含二硫键的蛋白质，细胞内：高度还原；外 界氧化环境。eg.二硫苏糖醇DTT，2-巯基乙醇 2-BME， 半胱氨酸Cys、谷胱甘肽GSH （还原型）
酶抑制剂：针对性添加，丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、巯 基蛋白酶抑制剂碘乙酸、金属蛋白酶EDTA，etc
•PVP：植物组织的破碎过程化中常用聚乙烯吡咯烷酮PVP 吸收酚类物质（酚类物质会与蛋白质结合形成沉淀）
细胞破碎（Cell disruption）
• 细胞的结构 • 动物/植物和微生物：前者没有细胞壁，只有脂质
from all others • quantitative, so that the success of the purification can be
monitored • economical in terms of time and material.
干扰素含量测定（MTT法生物学活性测定）
4、生物法破碎
• 自溶：通过调节温度、pH或添加有机溶剂等激活剂，诱 使细胞产生溶解自身酶的方法
• 溶菌酶是酶法溶胞中最常用的方法 • 但其高成本和有限的适用性使该法不可能实现大规模应用，
esp.G-的酶溶更受到了限制
5、超临界细胞破碎技术
• 超临界流体：温度和压力处于临界条件之上的流体，具有 类似于气体的性质（低黏度）和类似于液体的高密度，具 有较好的流动性能、传质性能和溶解性能
细胞壁组成 肽聚糖 磷壁酸 类脂质 蛋白质
G+ 60-95%
有 一般无
0
G10%
0 约20% 较高
• 酵母菌：由甘露聚糖、蛋白质和葡聚糖组成的“三明治” 结构，其中葡聚糖主要维持细胞壁强度
4.1 细胞破碎技术
• 细胞破碎的目的：使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏 （增大通透性）或破碎，释放其中的目标产物
• 活性定义：以保护半数(50％) Wish细胞免受病毒VSV损害 的最高干扰素稀释度为1个干扰素活性单位。
尿激酶活性测定
• 尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶，血纤蛋白溶酶原是唯 一的天然蛋白底物，在生物体内，它作用于精氨酸-缬氨 酸键，使纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶。
3、化学法破碎
• 用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分 • 酸碱、某些表面活性剂及脂溶性有机溶剂都可改变细胞壁
或膜的通透性，从而使内含物有选择性地渗透出来→化学 渗透法
•利用酸碱调pH；有机溶剂甲苯；表面活性剂十二烷基 磺酸钠、Triton X-100；螯合剂乙二胺四乙酸EDTA等
•优点：细胞外型完整、碎片少、粘度低，料液易澄清 •A、价格昂贵，引起新的污染； •B、一般只有有限的破碎，比机械破碎速度低、效率差，常需 与机械法连用。
• 利用超临界CO2做介质，高压CO2易于渗透到细胞内。突 然降压后，因细胞内外较大的压差使细胞急剧膨胀而发生 破裂
• 可破碎细胞壁较厚的细胞如酵母 • 甚至对粘稠的酵母浆都有很好的破碎效果
破碎方法的选择
• 选择的一般原则 • A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎 • B、提取产物在细胞膜附近，用化学法 • C、提取产物与细胞膜或细胞壁结合，可采用化学法和机
另取一烧杯，分别称取1 mmol EDTA； 0.15 mol NaCl； 2mol 尿素；3mmol GSH和0.6mmol GSSG
用buffer A溶解并定容至1L
方案1
• Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L，pH8.0）：50mL 0.1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与29.2mL 0.1 mol/L盐酸混 匀后，用去离子水定容至100mL。
械法结合的方法
破碎过程中应注意的问题 A、多种破碎方法相结合可产生很大优势 B、对下游分离技术的影响：破碎颗粒清除，产物分离纯化 C、在上游发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度影响 D、菌种的培育及改造，胞内产物 胞外产物
补充1
4.2 Buffers
• What is buffer？ • Why use buffer？
•可采用间歇式或连续操作珠磨机 •增加装珠量、延长破碎时间、提高 转速等手段可提高破碎率 •→总能耗增加且须注意换热
•适用于多数微生物细胞，esp.有大 量菌丝体的微生物（藻类和真菌菌丝）和 质地坚硬（亚细胞器）的微生物细胞
2）高压匀浆法
（ high-pressure homogenization ）
种酸或碱构成？） • Choose the species that gives no-products when titrated（选择一种，使得
其用HCl或NaOH滴定时无副产物出现）
•Calculate the mass required to give the required molarity •计算并称量配制溶液所需的质量 •Add all components, titrate to the pH and make up the volume •（加入所有其它组分，用HCl或NaOH 调至所需pH并定容） •pH计工作原理及使用注意事项
渗透压的水或缓冲液中，水进入细胞使胞壁和胞膜破裂
• 2）冻结－融化法（Freezing and Thawing） • 细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，反复操作多次使细胞破
坏，对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较 为有效
• 原理：干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞 Wish株、人喉癌细胞株Hep-2等)产生抗病毒蛋白，从而使 细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)的攻击，根据待测样品不 同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。
• 材料： VSV、Wish细胞、MTT、二甲亚砜(DMSO)、10 ％FCS RPMI1640、培养板、培养瓶、CO2孵箱、超净台、 酶标检测仪。
or molarity of the buffer due to common ion effects
方案2
• Choose the buffer（with a pKa as close as possible to the desired pH） • Indentify whether the buffer is made from an acid or a base（buf
珠磨法、压榨法 高压匀浆、超声破碎、撞击法
非机械法
干燥处理 溶胞作用
1）酶溶法 2）化学法 3）物理法
超临界细胞破碎
1、机械方法破碎
• 1）珠磨法（bead milling） ：细胞悬浮液与极小的研磨剂如玻 璃小珠、石英砂等一起高速搅拌，细胞与研磨剂之间相互 碰撞、剪切，使细胞达到某种程度破碎，释放内含物
• Before the protein can be isolated, it is necessary to conceive of(确定) an activity and to devise（设计） an appropriate assay.
• The activity assay should be: • specific, to define the protein of interest and distinguish it
和蛋白质构成的柔软的细胞膜，易于破碎 • 细菌：革兰氏阳性菌的细胞壁比阴性菌的细胞壁
坚固Why？较难破碎。 • 酵母或其他真菌：胞壁由葡聚糖、甘露聚糖等多
糖和蛋白质构成，比革兰氏阳性菌的胞壁厚
• G+：典型金黄色葡萄球菌，肽聚糖60-95% • G-：典型E.Coli，肽聚糖10% • 不同类型细菌的细胞壁结构成分：
补充2
4.3 Assays for activity and concentration
• Most proteins have some form of unique functional activity （具有一种活性）, which defines the specific protein.
“x”ml solution of A＋ “y”ml solution of B Involves extra work（making up two solutions） 缺点 Waste（The unused volumes of A and B are discarded） Usually inaccurate Why? The presence of extra salts may change the pH
• 破碎原理：利用高压使悬浮液通过针形阀，从阀座与阀之间的 环隙高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击后，急 剧释放到低压环境
• 破碎作用力：突然减压和高速冲撞
• 操作参数少且易于确定，实验 室及工业生产中均可
• 适用于酵母和多数细胞的破碎
• 对易造成堵塞的团状或丝状真 菌及一些易损伤匀浆阀、质地 坚硬的亚细胞器一般不适用 阀座
4、生物法破碎
• 原理：利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到 部分或完全破坏后再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜， 进一步增大胞内产物的通透性
• 优点：产品释放的选择性高、产品破坏少、对温度及 pH等外界条件要求低，不残留细胞碎片等，不同的细 胞壁结构决定了需要不同的酶
•溶菌酶lysozyme适用于G＋的细胞壁，若配合EDTA、TritonX100则可有效作用于G－的胞壁； •真核细胞需用不同的酶：酵母细胞需用葡聚糖酶或甘露聚糖 酶；破坏植物细胞壁需用纤维素酶
方案1
• 磷 酸 盐缓 冲 液 （ 1/15 mol/L， pH7.5 ） ： 600mL 1/15mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4）与400mL 1/15 mol/L磷酸二氢钠（NaH2PO4）混匀。
→1L 1/15 mol/L Na2HPO4 /NaH2PO4缓冲液、pH7.5 buffer A
机械破碎法总结
• 以上几种机械破碎法的作用机理不尽相同，有各自的适用范 围（包括菌体细胞、细胞发酵液的特性）和处理规模（实验 室或工业用）
方法
珠磨
高压匀浆 超声破碎
使用规模
实验室、工业用
实验室、工业用 实验室
适用对象 酵母、藻类及丝状真菌 酵母菌、细菌 细菌
2、细胞物理破碎方法
• 1）渗透压冲击法（osmotic shock） • 最为温和的一类细胞破碎方法，适用于易于破碎的细胞，
撞击环 阀
3）超声波破碎（ultrasonication）
• 机理：高于20kHz的超声作用下产生的空穴化作用，空穴由于 超声波的冲击而产生和闭合，产生极大的冲击波和剪切力。
缺点： A、影响因素多，细胞种类、浓度 和处理时间、探头材料和形状； B、有效能量的利用率低； C、产热大，需控温； D、不易放大，仅应用于实验室规 模的细胞破碎。
描述缓冲液的两个指标：缓冲液的摩尔浓度 缓冲液pH
小结
• 缓冲液的pKa值尽可能接近预期pH（pH±0.5） • 温度改变、溶液稀释及添加中性盐的情况下，缓冲液pH
变化尽可能小 • 缓冲物质不与实验中其他物质发生反应，不干扰实验的检
测（eg.硼酸盐/糖蛋白，280nm处有光吸收）
一般常用的缓冲液都有现成的配方，可查阅相关参考书 利用特定的缓冲液计算软件或者网上缓冲液计算软件： /users/mjfrbn/buffers/makebuf.asp
pH = pKa ± 0.5时，作为buffer，其缓冲能力最强
磷酸盐缓冲体系
For most biochemical purposes, pKa2 is of greatest interest－Why？
How to making a buffer？
• 溶液： • 1/15 mol/L Na2HPO4 /NaH2PO4 、pH7.5缓冲液 • 含1 mmol/L EDTA • 0.15 mol/L NaCl • 2mol/L尿素 • 3mmol/L GSH和0.6mmol/L GSSG • 1L
生化分离工程
第四章 细胞破碎和分离提取技术
破碎缓冲液
• 一般为0.1-0.2mol/L，pH为7－8的磷酸盐缓冲液或Tris缓 冲液（与细胞内环境相似）
抗氧化剂：含二硫键的蛋白质，细胞内：高度还原；外 界氧化环境。eg.二硫苏糖醇DTT，2-巯基乙醇 2-BME， 半胱氨酸Cys、谷胱甘肽GSH （还原型）
酶抑制剂：针对性添加，丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、巯 基蛋白酶抑制剂碘乙酸、金属蛋白酶EDTA，etc
•PVP：植物组织的破碎过程化中常用聚乙烯吡咯烷酮PVP 吸收酚类物质（酚类物质会与蛋白质结合形成沉淀）
细胞破碎（Cell disruption）
• 细胞的结构 • 动物/植物和微生物：前者没有细胞壁，只有脂质
from all others • quantitative, so that the success of the purification can be
monitored • economical in terms of time and material.
干扰素含量测定（MTT法生物学活性测定）
4、生物法破碎
• 自溶：通过调节温度、pH或添加有机溶剂等激活剂，诱 使细胞产生溶解自身酶的方法
• 溶菌酶是酶法溶胞中最常用的方法 • 但其高成本和有限的适用性使该法不可能实现大规模应用，
esp.G-的酶溶更受到了限制
5、超临界细胞破碎技术
• 超临界流体：温度和压力处于临界条件之上的流体，具有 类似于气体的性质（低黏度）和类似于液体的高密度，具 有较好的流动性能、传质性能和溶解性能
细胞壁组成 肽聚糖 磷壁酸 类脂质 蛋白质
G+ 60-95%
有 一般无
0
G10%
0 约20% 较高
• 酵母菌：由甘露聚糖、蛋白质和葡聚糖组成的“三明治” 结构，其中葡聚糖主要维持细胞壁强度
4.1 细胞破碎技术
• 细胞破碎的目的：使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏 （增大通透性）或破碎，释放其中的目标产物
• 活性定义：以保护半数(50％) Wish细胞免受病毒VSV损害 的最高干扰素稀释度为1个干扰素活性单位。
尿激酶活性测定
• 尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶，血纤蛋白溶酶原是唯 一的天然蛋白底物，在生物体内，它作用于精氨酸-缬氨 酸键，使纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶。
3、化学法破碎
• 用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分 • 酸碱、某些表面活性剂及脂溶性有机溶剂都可改变细胞壁
或膜的通透性，从而使内含物有选择性地渗透出来→化学 渗透法
•利用酸碱调pH；有机溶剂甲苯；表面活性剂十二烷基 磺酸钠、Triton X-100；螯合剂乙二胺四乙酸EDTA等
•优点：细胞外型完整、碎片少、粘度低，料液易澄清 •A、价格昂贵，引起新的污染； •B、一般只有有限的破碎，比机械破碎速度低、效率差，常需 与机械法连用。
• 利用超临界CO2做介质，高压CO2易于渗透到细胞内。突 然降压后，因细胞内外较大的压差使细胞急剧膨胀而发生 破裂
• 可破碎细胞壁较厚的细胞如酵母 • 甚至对粘稠的酵母浆都有很好的破碎效果
破碎方法的选择
• 选择的一般原则 • A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎 • B、提取产物在细胞膜附近，用化学法 • C、提取产物与细胞膜或细胞壁结合，可采用化学法和机
另取一烧杯，分别称取1 mmol EDTA； 0.15 mol NaCl； 2mol 尿素；3mmol GSH和0.6mmol GSSG
用buffer A溶解并定容至1L
方案1
• Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L，pH8.0）：50mL 0.1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与29.2mL 0.1 mol/L盐酸混 匀后，用去离子水定容至100mL。
械法结合的方法
破碎过程中应注意的问题 A、多种破碎方法相结合可产生很大优势 B、对下游分离技术的影响：破碎颗粒清除，产物分离纯化 C、在上游发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度影响 D、菌种的培育及改造，胞内产物 胞外产物
补充1
4.2 Buffers
• What is buffer？ • Why use buffer？
•可采用间歇式或连续操作珠磨机 •增加装珠量、延长破碎时间、提高 转速等手段可提高破碎率 •→总能耗增加且须注意换热
•适用于多数微生物细胞，esp.有大 量菌丝体的微生物（藻类和真菌菌丝）和 质地坚硬（亚细胞器）的微生物细胞
2）高压匀浆法
（ high-pressure homogenization ）
种酸或碱构成？） • Choose the species that gives no-products when titrated（选择一种，使得
其用HCl或NaOH滴定时无副产物出现）
•Calculate the mass required to give the required molarity •计算并称量配制溶液所需的质量 •Add all components, titrate to the pH and make up the volume •（加入所有其它组分，用HCl或NaOH 调至所需pH并定容） •pH计工作原理及使用注意事项