第四章 细胞破碎和分离提取技术 PPT课件

撞击环 阀
3）超声波破碎（ultrasonication）
• 机理：高于20kHz的超声作用下产生的空穴化作用，空穴由于 超声波的冲击而产生和闭合，产生极大的冲击波和剪切力。
缺点： A、影响因素多，细胞种类、浓度 和处理时间、探头材料和形状； B、有效能量的利用率低； C、产热大，需控温； D、不易放大，仅应用于实验室规 模的细胞破碎。
•可采用间歇式或连续操作珠磨机 •增加装珠量、延长破碎时间、提高 转速等手段可提高破碎率 •→总能耗增加且须注意换热
•适用于多数微生物细胞，esp.有大 量菌丝体的微生物（藻类和真菌菌丝）和 质地坚硬（亚细胞器）的微生物细胞
2）高压匀浆法
（ high-pressure homogenization ）
eg.动物细胞和革兰氏阴性菌。 • 细胞于高渗介质中？脱水达到平衡后，迅速将其转置于低
渗透压的水或缓冲液中，水进入细胞使胞壁和胞膜破裂
• 2）冻结－融化法（Freezing and Thawing） • 细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，反复操作多次使细胞破
坏，对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较 为有效
“x”ml solution of A＋ “y”ml solution of B Involves extra work（making up two solutions） 缺点 Waste（The unused volumes of A and B are discarded） Usually inaccurate Why? The presence of extra salts may change the pH
机械破碎法总结
• 以上几种机械破碎法的作用机理不尽相同，有各自的适用范 围（包括菌体细胞、细胞发酵液的特性）和处理规模（实验 室或工业用）
方法
珠磨
高压匀浆 超声破碎
使用规模
实验室、工业用
实验室、工业用 实验室
适用对象 酵母、藻类及丝状真菌 酵母菌、细菌 细菌
2、细胞物理破碎方法
• 1）渗透压冲击法（osmotic shock） • 最为温和的一类细胞破碎方法，适用于易于破碎的细胞，
和蛋白质构成的柔软的细胞膜，易于破碎 • 细菌：革兰氏阳性菌的细胞壁比阴性菌的细胞壁
坚固Why？较难破碎。 • 酵母或其他真菌：胞壁由葡聚糖、甘露聚糖等多
糖和蛋白质构成，比革兰氏阳性菌的胞壁厚
• G+：典型金黄色葡萄球菌，肽聚糖60-95% • G-：典型E.Coli，肽聚糖10% • 不同类型细菌的细胞壁结构成分：
pH = pKa ± 0.5时，作为buffer，其缓冲能力最强
磷酸盐缓冲体系
For most biochemical purposes, pKa2 is of greatest interest－Why？
How to making a buffer？
• 溶液： • 1/15 mol/L Na2HPO4 /NaH2PO4 、pH7.5缓冲液 • 含1 mmol/L EDTA • 0.15 mol/L NaCl • 2mol/L尿素 • 3mmol/L GSH和0.6mmol/L GSSG • 1L
酶抑制剂：针对性添加，丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、巯 基蛋白酶抑制剂碘乙酸、金属蛋白酶EDTA，etc
•PVP：植物组织的破碎过程化中常用聚乙烯吡咯烷酮PVP 吸收酚类物质（酚类物质会与蛋白质结合形成沉淀）
细胞破碎（Cell disruption）
• 细胞的结构 • 动物/植物和微生物：前者没有细胞壁，只有脂质
• 活性定义：以保护半数(50％) Wish细胞免受病毒VSV损害 的最高干扰素稀释度为1个干扰素活性单位。
尿激酶活性测定
• 尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶，血纤蛋白溶酶原是唯 一的天然蛋白底物，在生物体内，它作用于精氨酸-缬氨 酸键，使纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶。
3、化学法破碎
• 用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分 • 酸碱、某些表面活性剂及脂溶性有机溶剂都可百度文库变细胞壁
或膜的通透性，从而使内含物有选择性地渗透出来→化学 渗透法
•利用酸碱调pH；有机溶剂甲苯；表面活性剂十二烷基 磺酸钠、Triton X-100；螯合剂乙二胺四乙酸EDTA等
•优点：细胞外型完整、碎片少、粘度低，料液易澄清 •A、价格昂贵，引起新的污染； •B、一般只有有限的破碎，比机械破碎速度低、效率差，常需 与机械法连用。
4、生物法破碎
• 原理：利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到 部分或完全破坏后再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜， 进一步增大胞内产物的通透性
• 优点：产品释放的选择性高、产品破坏少、对温度及 pH等外界条件要求低，不残留细胞碎片等，不同的细 胞壁结构决定了需要不同的酶
•溶菌酶lysozyme适用于G＋的细胞壁，若配合EDTA、TritonX100则可有效作用于G－的胞壁； •真核细胞需用不同的酶：酵母细胞需用葡聚糖酶或甘露聚糖 酶；破坏植物细胞壁需用纤维素酶
• 破碎原理：利用高压使悬浮液通过针形阀，从阀座与阀之间的 环隙高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击后，急 剧释放到低压环境
• 破碎作用力：突然减压和高速冲撞
• 操作参数少且易于确定，实验 室及工业生产中均可
• 适用于酵母和多数细胞的破碎
• 对易造成堵塞的团状或丝状真 菌及一些易损伤匀浆阀、质地 坚硬的亚细胞器一般不适用 阀座
from all others • quantitative, so that the success of the purification can be
monitored • economical in terms of time and material.
干扰素含量测定（MTT法生物学活性测定）
另取一烧杯，分别称取1 mmol EDTA； 0.15 mol NaCl； 2mol 尿素；3mmol GSH和0.6mmol GSSG
用buffer A溶解并定容至1L
方案1
• Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L，pH8.0）：50mL 0.1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与29.2mL 0.1 mol/L盐酸混 匀后，用去离子水定容至100mL。
• 利用超临界CO2做介质，高压CO2易于渗透到细胞内。突 然降压后，因细胞内外较大的压差使细胞急剧膨胀而发生 破裂
• 可破碎细胞壁较厚的细胞如酵母 • 甚至对粘稠的酵母浆都有很好的破碎效果
破碎方法的选择
• 选择的一般原则 • A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎 • B、提取产物在细胞膜附近，用化学法 • C、提取产物与细胞膜或细胞壁结合，可采用化学法和机
• Before the protein can be isolated, it is necessary to conceive of(确定) an activity and to devise（设计） an appropriate assay.
• The activity assay should be: • specific, to define the protein of interest and distinguish it
4、生物法破碎
• 自溶：通过调节温度、pH或添加有机溶剂等激活剂，诱 使细胞产生溶解自身酶的方法
• 溶菌酶是酶法溶胞中最常用的方法 • 但其高成本和有限的适用性使该法不可能实现大规模应用，
esp.G-的酶溶更受到了限制
5、超临界细胞破碎技术
• 超临界流体：温度和压力处于临界条件之上的流体，具有 类似于气体的性质（低黏度）和类似于液体的高密度，具 有较好的流动性能、传质性能和溶解性能
or molarity of the buffer due to common ion effects
方案2
• Choose the buffer（with a pKa as close as possible to the desired pH） • Indentify whether the buffer is made from an acid or a base（buffer由哪
补充2
4.3 Assays for activity and concentration
• Most proteins have some form of unique functional activity （具有一种活性）, which defines the specific protein.
种酸或碱构成？） • Choose the species that gives no-products when titrated（选择一种，使得
其用HCl或NaOH滴定时无副产物出现）
•Calculate the mass required to give the required molarity •计算并称量配制溶液所需的质量 •Add all components, titrate to the pH and make up the volume •（加入所有其它组分，用HCl或NaOH 调至所需pH并定容） •pH计工作原理及使用注意事项
生化分离工程
第四章 细胞破碎和分离提取技术
破碎缓冲液
• 一般为0.1-0.2mol/L，pH为7－8的磷酸盐缓冲液或Tris缓 冲液（与细胞内环境相似）
抗氧化剂：含二硫键的蛋白质，细胞内：高度还原；外 界氧化环境。eg.二硫苏糖醇DTT，2-巯基乙醇 2-BME， 半胱氨酸Cys、谷胱甘肽GSH （还原型）
机械法
固体剪切作用 液体剪切作用
珠磨法、压榨法 高压匀浆、超声破碎、撞击法
非机械法
干燥处理 溶胞作用
1）酶溶法 2）化学法 3）物理法
超临界细胞破碎
1、机械方法破碎
• 1）珠磨法（bead milling） ：细胞悬浮液与极小的研磨剂如玻 璃小珠、石英砂等一起高速搅拌，细胞与研磨剂之间相互 碰撞、剪切，使细胞达到某种程度破碎，释放内含物
械法结合的方法
破碎过程中应注意的问题 A、多种破碎方法相结合可产生很大优势 B、对下游分离技术的影响：破碎颗粒清除，产物分离纯化 C、在上游发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度影响 D、菌种的培育及改造，胞内产物 胞外产物
补充1
4.2 Buffers
• What is buffer？ • Why use buffer？
• 原理：干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞 Wish株、人喉癌细胞株Hep-2等)产生抗病毒蛋白，从而使 细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)的攻击，根据待测样品不 同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。
• 材料： VSV、Wish细胞、MTT、二甲亚砜(DMSO)、10 ％FCS RPMI1640、培养板、培养瓶、CO2孵箱、超净台、 酶标检测仪。
方案1
• 磷 酸 盐缓 冲 液 （ 1/15 mol/L， pH7.5 ） ： 600mL 1/15mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4）与400mL 1/15 mol/L磷酸二氢钠（NaH2PO4）混匀。
→1L 1/15 mol/L Na2HPO4 /NaH2PO4缓冲液、pH7.5 buffer A
细胞壁组成 肽聚糖 磷壁酸 类脂质 蛋白质
G+ 60-95%
有 一般无
0
G10%
0 约20% 较高
• 酵母菌：由甘露聚糖、蛋白质和葡聚糖组成的“三明治” 结构，其中葡聚糖主要维持细胞壁强度
4.1 细胞破碎技术
• 细胞破碎的目的：使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏 （增大通透性）或破碎，释放其中的目标产物
描述缓冲液的两个指标：缓冲液的摩尔浓度 缓冲液pH
小结
• 缓冲液的pKa值尽可能接近预期pH（pH±0.5） • 温度改变、溶液稀释及添加中性盐的情况下，缓冲液pH
变化尽可能小 • 缓冲物质不与实验中其他物质发生反应，不干扰实验的检
测（eg.硼酸盐/糖蛋白，280nm处有光吸收）
一般常用的缓冲液都有现成的配方，可查阅相关参考书 利用特定的缓冲液计算软件或者网上缓冲液计算软件： http://www.bi.umist.ac.uk/users/mjfrbn/buffers/makebuf.asp