酵母菌的分离纯化

微生物学课程设计专业：生物技术

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从土样中分离纯化酵母菌

一、实验目的

1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理玉方法

2、学习、掌握微生物的鉴定方法

3、对提取的图样进行微生物的分离、纯化培养、并进行简单的形态鉴定

二、实验原理

1、基本思想:

酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4.5-6.0.酵

母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。

2、基本路线:

采样→稀释→接种→鉴定→纯化→保藏

菌种

三、器材和用品

1、器材：

小铁铲和无菌纸或袋、培养皿、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、量筒、滴管、吸水纸、无菌水试管、烧杯、三角瓶、电炉、玻璃棒、接种环、恒温培养箱、高温灭菌锅、移液枪（枪头）、天平、滤纸、pH试纸等。无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、显微镜、接种环等。

2、试剂：

a、美兰染液。

b、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g （煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。分装三角瓶；试管斜面1支/组。

c、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml 乳酸，pH为5.5左右，再分装试管9ml2支/组。

四、实验方法

1、采集土样带上小铁铲和无菌袋到果园土、菜园土等地采集较细碎土壤。

2、样品稀释在无菌纸上称取样品5g，放入100mL无菌水的三角瓶中，手摇10分钟使土和水充分混合。用1mL无菌吸管吸取0.5mL注入4.5mL无菌水试管中稀释。

3、分离在上述样品稀释液中，吸取lmL，接种灭菌了的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，倒置于37℃温箱中培养48小时。

4、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1ml，注入另装有乳酸马铃薯葡萄糖培养液

中，在28-30℃培养箱中培养24h。

5、镜检:用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液，混和均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原，故菌体不着色。

6、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取0.1ml加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。

7、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。

8、镜检：挑取单菌落，制片观察其形态。

9、菌种保藏：接种酵母菌到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，长出菌苔后冰箱保藏。