循环肿瘤细胞(CTC)的基础知识

循环肿瘤细胞（CTC）的一些基础知识

摘要：通常把进入人体外周血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞（circulating tumor cell）。随着人们对循环肿瘤细胞研究的深入，尤其是伴随现代检测技术的广泛应用，CTC逐渐被人们所重视。循环肿瘤细胞的检测可有效地应用于体外早期诊断，化疗药物的快速评估，个体化治疗包括临川筛药、耐药性的检测，肿瘤复发的监测以及肿瘤新药物的开发等。检测CTC 有着良好的应用前景，随着这一研究领域的不断发展，必将产生新的诊疗手段，从而使肿瘤的治疗提高到一个崭新的阶段。

关键词：循环肿瘤细胞；CTC；检测方法；临床意义

早在1896年，Ashworth曾报道1例因癌症死亡的患者外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）的概念[1]。随着人们对循环肿瘤细胞研究的深入，尤其是伴随现代检测技术的广泛应用，CTC逐渐被人们所重视。

1、概述

CTC指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞。随着肿瘤细胞的不断增殖,部分细胞可以通过分泌一种抑制黏附因子表达的物质,增加其运动能力并使之与肿瘤母体脱离。这些脱落的肿瘤细胞再分泌一种蛋白溶解酶，以破坏周边宿主结缔组织并进入脉管系统。诊疗操作也可使肿瘤细胞扩散进入外周血循环。

2、检测方法

2.1免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC）

这一检测方法基于抗原抗体结合反应的原理，利用单克隆抗体（McAb）与特异的肿瘤标记物结合，并通过酶与底物反应显色来判断肿瘤细胞的存在。检测的肿瘤标志物主要分三类：①上皮细胞角蛋白（CK），如CK19；②上皮细胞膜特异性抗原，如黏蛋白类，包括EMA、HMFG、HEA125等；③肿瘤相关糖蛋白（TAG），如TAG12。1980年，Sloane等首次

采用ICC的方法检测乳腺癌患者骨髓中的肿瘤细胞。该方法可以进行形态学分析，但是检

测的细胞量少，敏感性只有10－4～10－5（即在1万~10万个单核细胞中发现一个肿瘤细胞），而且许多分化差的肿瘤不能表达目标抗原，而非上皮细胞中细胞角蛋白和上皮细胞抗原亦可能阳性,故特异性不高。Braun等[2]认为由于CTC不表达白细胞共同抗原CD45，采用CD45－/CK＋双标技术可以提高ICC检测的特异性。

2.2多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）

该方法的原理是特异性扩增出肿瘤细胞中因癌基因、抑癌基因突变或染色体重排而产生

的DNA异常。这类基因的改变应满足以下条件：①该基因的突变在待检肿瘤中发生率较高，至少应达50％左右；②基因内发生碱基突变的部位应相对集中，如果过分分散，目前临床

应用有困难。这一方法检测肿瘤细胞的敏感性约1×10－6左右，比Southern印迹杂交法约提高10 000倍。应用PCR技术检测CTC受到缺乏肿瘤特异性和高表达标记的限制，该方法敏感度高，易出现假阳性，同时由于癌细胞的异质性亦可出现假阴性。目前多应用突变等位基因扩增（mutant allelie specific amplification, MASA）的PCR技术，检测大肠癌和胰

腺癌患者外周血中具有K-ras癌基因突变的肿瘤细胞。

2.3逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

这种方法在PCR的基础上扩增由肿瘤特异性mRNA序列逆转录的DNA片断。RNA检测的特异性靶mRNA有：①某些基因改变后RNA水平的异常，如点突变（p53、ras）、缺失（BRCA1、BRCA2）、异构（CD44）、扩增（erb- B2、EGFR）；②组织特异性标志mRNA,如mucin、cytokeratin、ER、maspin；③肿瘤特异性标志mRNA，如CEA、β-HCG 等。1991年Smith等[3]首先将RT-PCR应用于外周血黑色素瘤细胞的检测。此后，这一技术已分别在多种恶性实体瘤中得以应用，如对消化系统肿瘤作CEAmRNA检测，对乳腺癌作MAMmRNA检测，对肝癌作AFPmRNA检测，对前列腺癌作PSAmRNA检测等。RT-PCR 方法具有高度的敏感性和特异性，其敏感性可达10－6~10－7，特异性在于其扩增模板为mRNA：RNA在细胞外环境中极不稳定，一旦检测到特异性mRNA的表达就意味着有肿瘤细胞的存在；mRNA的表达不受相应编码蛋白表达高低的影响；引物的设计可以跨越两个不同的外显子，避免了整个基因组的扩增，有利于消除假阳性结果。由于RNA易被RNA 酶降解，同时该方法具有PCR技术的局限性，仍可出现假阳性和假阴性结果。为提高

RT-PCR的特异性和敏感性，新的方法不断产生，在RT-PCR的基础上又增加了定量逆转录多聚酶链反应（QPCR）,荧光定量逆转录多聚酶链反应（FQ-PCR）等。

2.4流式细胞术（flow cytometry, FCM）

该技术是以流式细胞仪为工具对悬液中的细胞进行测量分析，具有快速、准确的优点，其筛选细胞的速度为103~104个细胞/s。应用FCM从血液中检测上皮性肿瘤细胞其价值很大程度上依赖于可分析的细胞数量[4]。尽管FCM不能提供有关细胞形态方面的信息，但是,其在鉴定、计数肿瘤细胞方面比RT-PCR更可靠。Irene等研究证明FCM可作为一种检测CTC数量的有力工具。现有的FCM需取大约50ml外周血方可检测肿瘤细胞负荷，若检测前进行特异性富集肿瘤细胞，将在很大程度上提高检测的敏感性。

2.5其它

目前，CTC检测方法较多，但检出率仍有限，一些明确存在转移灶的患者CTC阳性率可能很低。导致这一情况的原因可能是不了解肿瘤细胞释放的规律（CTC的释放可能是间歇性的），且循环中的肿瘤细胞常常成群，单点时间的检测可产生一定的偏倚，而实际表达可能更高。连续多次取样或加大样本量可能会提高检出率。再者，检测方法本身也都存在一定的局限性，可能出现假阳性与假阴性。在设立对照，均衡、优化实验条件的同时，可选用免疫磁性分离技术即磁性激活的细胞筛选（magnetic activated cell separation，MACS）富集肿瘤细胞、激光扫描细胞计数器等来提高检测的敏感性和特异性。Vona等[5]。根据上皮肿瘤细胞的大小建立了一种简便、经济的分离计数CTC的方法，即利用上皮肿瘤细胞比外周血细胞大的特点，通过过滤使之得到分离、富集。该方法敏感度高，1ml血中有1个肿瘤细胞也可检出，适用于多种类型的肿瘤。已有研究表明，在肝癌患者外周血肿瘤细胞的收集方面，该方法的敏感性比RT-PCR方法更高，若与其它方法联合应用可显著提高检测效率和准确性。

3、临床意义