定量PCR方法及数据分析

基线：扩增曲线中的水平部分 阈值（Threshold):指扩增曲线的指数增长区域 内适当位置上设定的荧光检测界限。
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Ct值：从基数到指数增长的拐点所对应的循环次 数
定量PCR数学原理
定量PCR技术的应用



定性分析：病毒病原菌检测、生物品种鉴定、 SNP 分析等、基因突变分析等 绝对定量：基因拷贝数分析，病毒病原菌定量分 析等 相对定量：mRNA表达分析，siRNA表达分析等
目标基因表达量（处理组/非处理 组）的差异
Livak, K. J et al. "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method."
定量PCR原理、应 用及数据分析
ZJW
原理：

PCR（多聚酶链式反应)：一种体外扩增特异DNA片 段的技术。反应分为变性（denaturation）、退火 （annealing）、延伸（extension）三步。

PCR扩增理论方程：
起点定量与终点定量： 起点的DNA量为“天然”的含量，更有意义；终 点的DNA量为经过PCR过程 “加工”的量，存在 部分“失真”。（终点定量存在更大的误差）


反应体系的配制 （25ul体系）
组分 模板cDNA 10uM引物F/R 2x SYBR Green mix
ddH2O
加量 2uL 各0.5uL 12.5uL
9.5uL
熔解曲线
绝对定量：从荧光强度到拷贝数
相对定量的数据分析
(2-ΔΔCt法/comparative Ct method)
Livak, K. J et al. "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method."


定量PCR：通过实时监测PCR每一个循环扩增产物 相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量 或者定性的分析 化学原理：荧光染料嵌合法, 探针法
SYBR Green I（不饱和型）， Eva Green / LC Green （饱和 型），与dsDNA小沟部位嵌合， 具有绿色激发波长。游离时不 发光。 缺点：需用melting curve检测 产物特异性。
探针法：可用于多重PCR及基因分型
TaqMan 探针：检测积累荧光 一种寡核苷酸探针, 探针两端各锚定一个基团，淬灭剂 则在3‘末端。
Taqman探针识别并结合特定 的靶序列； 探针完整时，报告基团R发 出的荧光被淬灭基团Q吸收； 在进行延伸反应时,Taq聚合 酶的 5’外切酶活性将探针 切断, 使得荧光基团与淬灭 剂分离,发射荧光。一分子 的产物生成就伴随着一分子 的荧光信号的产生。
内参基因的选择：



内参：用于去除不同样本在RNA的产量、质量以及 逆转录效率差异对目标基因表达的影响。 稳定表达于不同类型的组织和细胞中（如正常细 胞和癌细胞），而且其表达量无显著差异； 高度或中度表达，排除太高或太低表达； 表达水平与细胞周期、细胞是否活化无关，且不 受任何外源性和内源性因素的影响。
常见几种内参基因的优缺点：

GAPDH：在不同癌组织（包括肺癌、乳腺癌、肾细胞癌 ）中表达升高，在不同个体间、妊娠期间以及细胞周期的 不同阶段，以及多种因素刺激下（包括低氧、胰岛素、地 塞米松、丝裂原、表皮生长因子等）表达存在差异；

β-actin：细胞恶性转化时表达水平增加；
18S rRNA: rRNA合成的调节独立于mRNA。rRNA不包括 Poly A尾，在以Oligo dT作为引物的cDNA合成中不能被 转录。rRNA高丰度表达，远高于目标基因，较其他内参 基因稳定，且受RNA降解的影响比较小。
Livak, K. J et al. "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method."
Livak, K. J et al. "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method."
定量PCR实验流程
目标基因的查找、比对
引物、探针的设计与合成
反应体系和条件的优化
数据分析
定量PCR引物设计的要求：



① Tm=55-65℃ ② GC=30-80% ③ PCR 扩增产物长度：引物的产物大小不要太 大，一般在 80-300bp 之间都可。 ④ 引物的退火温度要高，一般要在 60℃以上。