土壤微生物脂肪酸

一、实验名称
土壤微生物脂肪酸分析方法（FAMEs）
二、实验目的
通过测定土壤磷脂中脂肪酸的组成，可以估算土壤微生物生物量及其群落结构与多样性状况。

三、实验原理
土壤磷脂分析方法的基本原理是，将新鲜土壤用浸提剂浸提，再进行萃取和色谱柱分离出磷脂，磷脂中的磷含量可指示微生物生物量。

磷脂与甲醇进行酯化反应，形成脂肪酸甲酯，再用色谱法测定各种脂肪酸含量。

四、实验仪器及分析方法
GC－MS测试采用日本岛津QP-5000GC-MS仪。

色谱柱为DB-1（28m×0.25 mm）石英弹性毛细柱。

采用程序升温100~270℃，5℃/min。

界面温度为280℃。

汽化室温度280℃，离子源温度260℃，电子能量：70eV。

不同样品测定之间，在270℃下清洗柱子2min，质谱图的确认采用NIST62LIB及NIST12LIB谱库检索及EPA/NIH质谱标准图相结合。

五、实验步骤
土壤微生物脂肪酸的甲脂化和提取
1.将15mL的0.2M的KOH甲醇溶液和相当于烘干重3g的新鲜土壤加到35mL
的离心试管中。

2.混合均匀，在37℃下温育1h(脂肪酸释放，并甲脂化，每10分钟涡悬样品一次)。

3.加3mL的1.0M醋酸于离心管中，混匀。

4.加10mL的正己烷，使FAMEs转到有机相中，480×g离心10分钟。

5.将正己烷相转到干净试管中，在N2气流下挥发掉溶剂。

6.将FAMEs溶解在0.5mL的1：1（V/V）的（正己烷：甲基叔丁基醚(methyl-tert
butyl ether)），作GC-MS分析。

六、实验数据处理方法
细菌往往不含有多个不饱和键的脂肪酸，链长是奇数、带支链的、主链上含有
环丙基或羟基。

真菌的脂肪酸大多含有多个不饱和键。

革兰氏阳性菌（GP）含有较大比例的带支链的脂肪酸，革兰氏阴性菌（GN）在其类脂多糖类A中有较大比例的羟基脂肪酸，FAMEs可作为总细菌数、GN、GP和真菌的生物标记物，其中细菌总数: 15:0, i15:0, a15:0, i16:0, 17:0, i17:0, a17:0, cy17:0, cy19:0; GN细菌：cy17:0, cy19:0; GP菌：15:0, i15:0, a15:0, i16:0, 17:0, i17:0, a17:0；真菌：18:2 ω6c；18:2 ω6c/总细菌FAMEs量可代表真菌/细菌生物量比值（Zogg et al., 1997; Zelles, 1999）。

在用脂肪酸剖面来估计土壤微生物多样性时，Pi表示各脂肪酸峰面积/总脂肪酸峰面积的百分比值，ni为第i种脂肪酸峰面积/c16:0峰面积的比值，N表示各脂肪酸峰面积/c16:0的峰面积的总和，S表示可提取的脂肪酸种类数。

七．实验方法分析
1.FAME分析结果的准确性与微生物体内的磷脂脂肪酸是否提取完全、稳定以
及实验过程是否造成污染等有很大关系。

2.细菌和真菌可根据其磷脂脂肪酸的组成来鉴别，但不同属甚至不同科的微生
物FAME有可能重叠，而且该方法只能鉴定到微生物属，不能鉴定到种。

3.该方法一个明显的缺陷是实验条件要求高，耗时长，成本高，因而在实际研
究工作中常受到一定的限制，最适合用作总微生物群落分析。