荧光分析技术与应用
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荧光和磷光产生的示意图
二、基本原理
b.内部能量转换（internal conversion)：
电子常常由高能级以非 S2* 辐射跃迁方式转移至低能
级，这种过程称为内部能
量转换.
S1*
特点：两个电子的 能级非常靠近以致其振 S0 动能级有重叠时内部转 换易发生。 10-1~10-13 秒可完成。
ννννν02134
b
ννννν02134
e
ννννν02134
T1
S0
a
d
f
ννννν02134
a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换； d.荧光；e.体系间跨越；f.磷光
荧光和磷光产生的示意图
二、基本原理
（3）荧光与磷光的比较：
成因
E λ
荧光
磷光
激发单重态 基态 激发三重态 基态单
单重态
重态
E激发≥E荧光＞E磷光
一、概述
• 2、荧光分析法（Fluorometry)
根据物质的荧光谱线位置及其强度鉴定物质并测定物 质含量的方法称为荧光分析法。
根据光源不同，荧光可分为X射线荧光法（X-ray fluorometry)、原子荧光法（Atomic Fluorometry)及分 子荧光法（Molecular Fluorometry).
bc
b
ννννν02134
e
ννννν02134
T1
特点：磷光能量比荧 光小，波长比荧光长; 发射时间长,约为10-
4~10秒（分子激发三
S0
a
d
f
ννννν02134
a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换；d.荧光；e.体系间跨 越；f.磷光
重态的寿命较长） 。
荧光和磷光产生的示意图
二、基本原理
RoHS AnalyzerX射线荧光光谱仪
原子荧光光度计
LS45荧光分光光度计
一、概述
• 3、荧光分析法与 • 紫外－可见分光光度法和红外光谱法的比较：
荧光
红外和紫外可见
相同点
分子光谱
分子光谱
不同点
本质 灵敏度 选择性
发射光谱
10-8~10-10g/mL
高
吸收光谱
10-5~10-7g/mL
一般
荧光分析法（Fluorometry)
荧光分析法（Fluorometry)
一
概述
二
基本原理
三
荧光定量分析方法
四
荧光分析技术与应用
五
小结
荧光分析法（Fluorometry)
一
概述
二
基本原理
三
荧光定量分析方法
四
荧光分析技术与应用
五
小结
一、概述 • 1、荧光（Fluorescence)
荧光棒
荧光手镯
物质吸收光子能量而被激发，然后从激发单线态的最 低振动能级回到基态时所发射出的光称为荧光。
λ激发≤ λ荧光＜ λ磷光
照射后发射 的时间
10-9~10-7秒
10-4~10秒
二、基本原理
（4）无辐射跃迁与光致发光
a.无辐射跃迁：指处于激发态的分子或原子通过碰撞， 以热能或动能的形式消耗其能量，降低到较低能级，这 种能级的变化叫无辐射跃迁。 ▲最常见的无辐射跃迁有：振动迟豫、内部能量转换、 外部能量转换和体系间跨越。
从电子激发态的某一振
动能级到达同一电子激
发态的最低振动能级的
S1*
过程为振动驰豫（如右
ννννν02134
bc
b
ννννν02134
e
ννννν02134
T1
图b所示）。
S0
特点：发生在同一
a
d
f
ννννν02134
个激发态的电子能级 上；时间约10-12秒。
a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换；d.荧光；e.体系间跨 越；f.磷光
所示）。
S1*
例如：S1*
T1
特点：振动能级重迭 时，产生体系间跨越的 S0 可能大;跨越后，荧光 量子减弱,甚至会荧光 熄灭.
ννννν02134
bc
b
ννννν02134
e
ννννν02134
T1
a
d
f
ννννν02134
a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换； d.荧光；e.体系间跨越；f.磷光
π*
π*
π*
π
π
π
a 基态单重态 b 激发态单重态 c 激发态三重态
二、基本原理
跃迁类型 单重态 单重态
△E
大
自旋方向
不变
单重态 三重态
小 改变
跃迁几率
≈1
10-6（光学禁阻，
几率小）
跃迁类型的比较
（2）荧光的产生
处于激发态的分子返回到基态共有以下几种途径：
a.振动驰豫
（vibrational relexation)： S2*
电子由第一激发态单 线态的最低振动能级跃 S2* 迁到基态的任一振动能 级而发射的光量子为荧 光（如右图d所示）。 S1*
特点：荧光的能量
ννννν02134
bc
b
ννννν02134
e
ννννν02134
T1
小于所吸收的紫外光 的能量，故发射荧光 的波长比吸收的紫外 光波长更长；时间约
S0
a
d
f
ννννν02134
外部能量转换 （external conversion)：
如果分子在溶液中激 发，在激发总分子之间、 分子与溶剂分子之间或 通过与其他分子的碰撞 而失去能量，常以热能 的方式放出，这个过程 称为外部能量转换。
特点：发生分子与 分子的碰撞时；时间
约10-9~10-7秒。
S2*
ννννν02134
bc
S1 *
一
概述
二
基本原理
三
荧光定量分析方法
四
荧光分析技术与应用
五
小结
二、基本原理
• 1、分子荧光光谱源自文库产生 （1）分子能级与电子能级的多重性(M=2S+1)
单重态（singlet state):总自旋S=0，两个电子自旋 相反，M=2S+1=1,用符号S表示。
三重态（triplet state):总自旋S=1，两个电子自旋 方向平行，M=2S+1=3，用符号T表示。
荧光和磷光产生的示意图
二、基本原理
影响体系间跨越几率增大的因素： ▲含重原子如碘、溴等的分子，体系间跨越最为常见。 原因：高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道 运动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反转的 发生。 在溶液中存在氧分子等顺磁性物质也能增加体系间跨 越的发生几率。
二、基本原理
d.荧光（Fluorescence)：
a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换；d.荧光；e.体系间跨 越；f.磷光
为10-14~10-8 。
荧光和磷光产生的示意图
二、基本原理
e.磷光（Phosphorescence)：
由第一电子激发态三 线态的最低振动能级跃
S2*
迁到基态单线态任一振
动能级发射的光量子为 S1* 磷光.
ννννν02134
bc
b
ννννν02134
e
ννννν02134
T1
a
d
f
ννννν02134
a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换； d.荧光；e.体系间跨越；f.磷光
荧光和磷光产生的示意图
二、基本原理
c.体系间跨越
（intersystem crossing)
受激分子的电子在激 S2* 发态发生反旋而改变多
重性的过程（如右图e
二、基本原理
b.内部能量转换（internal conversion)：
电子常常由高能级以非 S2* 辐射跃迁方式转移至低能
级，这种过程称为内部能
量转换.
S1*
特点：两个电子的 能级非常靠近以致其振 S0 动能级有重叠时内部转 换易发生。 10-1~10-13 秒可完成。
ννννν02134
b
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ννννν02134
T1
S0
a
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a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换； d.荧光；e.体系间跨越；f.磷光
荧光和磷光产生的示意图
二、基本原理
（3）荧光与磷光的比较：
成因
E λ
荧光
磷光
激发单重态 基态 激发三重态 基态单
单重态
重态
E激发≥E荧光＞E磷光
一、概述
• 2、荧光分析法（Fluorometry)
根据物质的荧光谱线位置及其强度鉴定物质并测定物 质含量的方法称为荧光分析法。
根据光源不同，荧光可分为X射线荧光法（X-ray fluorometry)、原子荧光法（Atomic Fluorometry)及分 子荧光法（Molecular Fluorometry).
bc
b
ννννν02134
e
ννννν02134
T1
特点：磷光能量比荧 光小，波长比荧光长; 发射时间长,约为10-
4~10秒（分子激发三
S0
a
d
f
ννννν02134
a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换；d.荧光；e.体系间跨 越；f.磷光
重态的寿命较长） 。
荧光和磷光产生的示意图
二、基本原理
RoHS AnalyzerX射线荧光光谱仪
原子荧光光度计
LS45荧光分光光度计
一、概述
• 3、荧光分析法与 • 紫外－可见分光光度法和红外光谱法的比较：
荧光
红外和紫外可见
相同点
分子光谱
分子光谱
不同点
本质 灵敏度 选择性
发射光谱
10-8~10-10g/mL
高
吸收光谱
10-5~10-7g/mL
一般
荧光分析法（Fluorometry)
荧光分析法（Fluorometry)
一
概述
二
基本原理
三
荧光定量分析方法
四
荧光分析技术与应用
五
小结
荧光分析法（Fluorometry)
一
概述
二
基本原理
三
荧光定量分析方法
四
荧光分析技术与应用
五
小结
一、概述 • 1、荧光（Fluorescence)
荧光棒
荧光手镯
物质吸收光子能量而被激发，然后从激发单线态的最 低振动能级回到基态时所发射出的光称为荧光。
λ激发≤ λ荧光＜ λ磷光
照射后发射 的时间
10-9~10-7秒
10-4~10秒
二、基本原理
（4）无辐射跃迁与光致发光
a.无辐射跃迁：指处于激发态的分子或原子通过碰撞， 以热能或动能的形式消耗其能量，降低到较低能级，这 种能级的变化叫无辐射跃迁。 ▲最常见的无辐射跃迁有：振动迟豫、内部能量转换、 外部能量转换和体系间跨越。
从电子激发态的某一振
动能级到达同一电子激
发态的最低振动能级的
S1*
过程为振动驰豫（如右
ννννν02134
bc
b
ννννν02134
e
ννννν02134
T1
图b所示）。
S0
特点：发生在同一
a
d
f
ννννν02134
个激发态的电子能级 上；时间约10-12秒。
a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换；d.荧光；e.体系间跨 越；f.磷光
所示）。
S1*
例如：S1*
T1
特点：振动能级重迭 时，产生体系间跨越的 S0 可能大;跨越后，荧光 量子减弱,甚至会荧光 熄灭.
ννννν02134
bc
b
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ννννν02134
T1
a
d
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ννννν02134
a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换； d.荧光；e.体系间跨越；f.磷光
π*
π*
π*
π
π
π
a 基态单重态 b 激发态单重态 c 激发态三重态
二、基本原理
跃迁类型 单重态 单重态
△E
大
自旋方向
不变
单重态 三重态
小 改变
跃迁几率
≈1
10-6（光学禁阻，
几率小）
跃迁类型的比较
（2）荧光的产生
处于激发态的分子返回到基态共有以下几种途径：
a.振动驰豫
（vibrational relexation)： S2*
电子由第一激发态单 线态的最低振动能级跃 S2* 迁到基态的任一振动能 级而发射的光量子为荧 光（如右图d所示）。 S1*
特点：荧光的能量
ννννν02134
bc
b
ννννν02134
e
ννννν02134
T1
小于所吸收的紫外光 的能量，故发射荧光 的波长比吸收的紫外 光波长更长；时间约
S0
a
d
f
ννννν02134
外部能量转换 （external conversion)：
如果分子在溶液中激 发，在激发总分子之间、 分子与溶剂分子之间或 通过与其他分子的碰撞 而失去能量，常以热能 的方式放出，这个过程 称为外部能量转换。
特点：发生分子与 分子的碰撞时；时间
约10-9~10-7秒。
S2*
ννννν02134
bc
S1 *
一
概述
二
基本原理
三
荧光定量分析方法
四
荧光分析技术与应用
五
小结
二、基本原理
• 1、分子荧光光谱源自文库产生 （1）分子能级与电子能级的多重性(M=2S+1)
单重态（singlet state):总自旋S=0，两个电子自旋 相反，M=2S+1=1,用符号S表示。
三重态（triplet state):总自旋S=1，两个电子自旋 方向平行，M=2S+1=3，用符号T表示。
荧光和磷光产生的示意图
二、基本原理
影响体系间跨越几率增大的因素： ▲含重原子如碘、溴等的分子，体系间跨越最为常见。 原因：高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道 运动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反转的 发生。 在溶液中存在氧分子等顺磁性物质也能增加体系间跨 越的发生几率。
二、基本原理
d.荧光（Fluorescence)：
a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换；d.荧光；e.体系间跨 越；f.磷光
为10-14~10-8 。
荧光和磷光产生的示意图
二、基本原理
e.磷光（Phosphorescence)：
由第一电子激发态三 线态的最低振动能级跃
S2*
迁到基态单线态任一振
动能级发射的光量子为 S1* 磷光.
ννννν02134
bc
b
ννννν02134
e
ννννν02134
T1
a
d
f
ννννν02134
a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换； d.荧光；e.体系间跨越；f.磷光
荧光和磷光产生的示意图
二、基本原理
c.体系间跨越
（intersystem crossing)
受激分子的电子在激 S2* 发态发生反旋而改变多
重性的过程（如右图e