L-丝氨酸酶法生产工艺放大试验_8

• 生产流程简述 :
• 本设计采用离子交换层析对两种氨基酸（L-丝氨酸和L-甘氨酸） 进行分离。
• 基本流程：
• 反应液→离子交换层析→浓缩→结晶→过滤干燥→产品 • 反应过程: 发酵结束后收集菌体，菌体沉淀中加入蒸馏水制成 菌悬液，细胞破碎后加入5-磷酸吡哆醛（PLP，终浓度为 2mmol/L），37℃温育24h。然后加入四氢叶酸（终浓度为 25mmol/L）、甘氨酸（终浓度为2mol/L）、37％的甲醛溶液（ 终浓度为50mmol/L）进行酶反应72h
放大后：
m丝 80 300 0.267 t 2.67 105 g
放大倍数ห้องสมุดไป่ตู้
2.67 105 2.539 105160倍 0.157 105160 3 49530L
V
放大总
记：放大倍数m 105160
V NaoH
4V
放大
4 16510 66040L
7
制备工艺路线
发酵过程
• • • • • 原材料及产品的主要技术规格 培养基：LB培养基 蛋白胨 10g 酵母浸出液 5g 氯化钠 5g 水 1L
• 发酵流程
• 1.将LB培养基共0.25m3放入0.3m3的种子罐配料罐中，待搅拌均 匀后，用泵打入种子罐中，种子罐用138℃水蒸气进行夹套加热 灭菌（使培养基从25℃升至121℃），再用冷却水使之冷却到 37℃，接入菌种后培养到对数期待用。
国内外的生产情况
• L-丝氨酸的主要生产方法有以下四种。 • 蛋白质水解法：L-丝氨酸在丝胶蛋白中的含量丰富，蚕茧衣中含 量为13.64%，因此，可用水解蚕茧衣制取。 • 添加前体发酵法：L-丝氨酸在生物体内代谢运转速度极快，直接 发酵法生产困难。一般采用添加前体的发酵法。添加的前体主要 有甘氨酸、甘氨酸三甲内盐或甘油酸，其中以甘氨酸为前体的已 工业化。产生菌可分为两类：异养型和甲基营养型细菌。 • 化学合成法：DL-丝氨酸可有以羟基乙醛为原料的合成法等，然后 再拆分得L-丝氨酸。 • 酶法：利用丝氨酸羟甲基转移酶催化甲醛和甘氨酸（Gly）可逆的 合成L-Ser，反应过程中SHMT需PLP和四氢叶酸（THFA）作为其辅 因子，由于主要原料来源广泛、价格低廉，并可合成高浓度的产 物，因此该法是目前最有应用前景的L-Ser生产方法。
得：m冷凝水 5512Kg
• ƞ=5%~10%，取10%
m冷凝水，实 1.1 5512 6063Kg
• • • • • •
主要设备的计算 离子交换罐的计算 选择反吸附离子交换罐 V 49530L 已知离子交换树脂总体积： 放大总 H / D 3 离子交换罐高径比（H/D）为3，即 2 D 树脂层高度占圆筒高度的50%,即 0.5H V放大总 49530L 4 D 34.7dm 3.47m
• 代入公式： 7281 4.2 100-27 225810 6934 m水蒸气 2116 • 求得: m水蒸气 6674Kg • ƞ=5%~10%，取10% m蒸汽，实 1.1 m水蒸气 1.1 6674 7341Kg
9
• 即:水蒸气的估计用量为7341Kg.
• • • •
冷却器 假定物料冷却至37℃ t t 根据能量守恒定律得：m料 C p, m 1 T2 T3 m冷凝水 C p, m 1 1 2 其中 m料 1 m水 m丝氨酸 1 6934 0.216510105 1000 1040Kg 10 10 1040 100 37 m冷凝水 37 27
2017/4/8
发酵放大主要过程示意图
2017/4/8
分离纯化所需原材料及产品的主要技术规格
• • • • • • • • • 生产原料 氢氧化钠溶液用量66040L 浓度1M 盐酸用量66040L pH=2 无水乙醇用量2080L 去离子水用量99060L 717型离子交换树脂用量49530L 产品的主要技术规格 生产规模：80 吨/年 生产方法：717型离子交换树脂离子交换层析后，进行浓缩，之 后添加乙醇结晶，离心分离 • 生产天数：300天 • 生产周期：1天 • 生产方式：间歇生产
2017/4/8
• 工艺分离 • 生产条件: • 已知L-丝氨酸的小试纯化工艺为：717型离子交换树脂用1M的NaOH溶 液处理成OH-型，水洗至中性后装柱（三根Φ25×500mm的柱子）。 对第一根柱子上样，上样结束后水洗。然后连接另2根柱子，用pH=2 的Hcl洗脱，分别收集只含L-丝氨酸、L-甘氨酸，以及同时含这两种氨 基酸的洗脱液。假设一个柱子的体积为V，已知NaOH溶液用量为4V， 洗涤水用量为2V，洗涤液用量为4V，其中含氨基酸的洗脱液体积为 1V，含L-丝氨酸的洗脱液体积为0.42V。将含L-丝氨酸的洗脱液浓缩液 浓缩至原体积的1/10，加入3倍体积的无水乙醇，将晶体（湿含量 15%）离心烘干，L-丝氨酸的分离得率为77%。年操作日300天，生产 方式：间歇生产。 • 水蒸气138℃，冷却水由27℃进，37℃出。
• 浓缩罐 • 采用间接蒸汽加热至沸腾（加热蒸汽为138℃） • 根据能量守恒定律得： 9
m物C p, m1 T2 T1 1
10
m水 m水蒸气 2
• 其中：
m物 m水 m丝 m水 V丝 水 69341 6934Kg m物 6934 0.216510105 1000 7281Kg
用途与发展前景
• L-丝氨酸虽属于非必需氨基酸 但具有许多重要 的生理功能和作 用,因此 ,在医药 、食品 、化妆品中均有较为广泛的应用。丝氨 酸是重要的自然保湿因子(N MF) 之一,皮肤角质层保持水分的主 要角色, 因此是很多高级化妆品中的关键添加剂, 只是因其价格 限制了它在化妆品中的应用。 • L-丝氨酸广泛用于配置第三代复方氨基酸输液和营养增补剂， 并用于合成多种丝氨基酸衍生物，如心血管 、抗癌、爱滋病新 药及基因工程用保护氨基酸等。 • 抗衰老作用。 • 食品：L-丝氨酸用于运动饮料 、氨基酸减肥饮料等。 • 饲料：L-丝氨酸用于动物饲料，可促进动物生长发育；
• • •
•
• 药理作用：
• 磷脂酰丝氨酸补充剂能增加大脑皮层中的神经传递质乙酰胆碱 的产量，乙酰胆碱与思维、推理和注意力集中有关联。磷脂酰 丝氨酸也能刺激多巴胺的合成和释放。磷脂酰丝氨酸似乎和大 脑对压力的反应有关联。一项临床研究发现，在针对健康人施 加压力的实验中，服用磷脂酰丝氨酸的人群对于压力的反应要 比其他人群低。压力反应是通过衡量血液中促肾上腺皮质激素 水平得出的，促肾上腺皮质激素是由脑下垂体分泌的一种激素， 它随之促进肾上腺分泌应激激素皮质醇。磷脂酰丝氨酸主要用 于治疗痴呆症（包括阿兹海默症和非阿兹海默症的痴呆）和正 常的老年记忆损失。
2017/4/8
• 离子交换层析过程 • 采用717型离子交换树脂，将其装入离子交换罐，保证其密实。 然后用氢氧化钠水溶液处理（溶液浓度为1M，体积为66040L） 使离子交换柱呈碱性，处理完之后上样。上样后，L-丝氨酸和L甘氨酸吸附在交换树脂上，可用酸性溶液洗脱，本设计采用 pH=2的Hcl溶液洗脱，用量为66040L，洗脱前需要用去离子水洗 涤，最终可得氨基酸溶液为16510L，其中L-丝氨酸为6934L。
L-丝氨酸酶法生产工艺放大试验
目录
• • • • • • • • • • • 概述 制药工艺路线及研究阶段 原材料及产品的主要技术规格 生产流程简述 发酵工艺放大优化 分离纯化放大与优化 产品的检验与分析 主要设备的计算 种子罐 发酵罐 离子交换罐
研究内容：L-丝氨酸
• 概述 L-丝氨酸是一种脂肪族极性α氨基酸。L-丝氨酸是组
1 1 • 浓缩罐： V丝，缩 V丝 6934 693.4L 10 10
• 离心机： V乙醇 3V丝，缩 3 693.4 2080.2L
• 能量衡算： 查表得： 100C水的比热容：C p, m1 4.2KJ /( Kg K )
100C水的气化潜热： 1 2258KJ / Kg 138C水蒸气的比热容：C p, m2 1.901KJ /( Kg K ) 138C水蒸气的气化潜热 : 2 2116KJ / Kg
2017/4/8
• 离子交换罐
• 小试生产时：
20 V 2 2
500 157000 mm3 0.157 L
nL - 丝 nL 甘 0.2V 0.2 0.157 0.0314 mol n得丝 0.0314 0.77 0.024178 mol m得丝 0.024178 105 2.539 g
• 结晶过程 • 离子交换层析完毕后，对料液进行浓缩。采用蒸汽加热，可将 料液浓缩至原体积的1/10。 • 浓缩过程： • 待浓缩液冷却后，加入208L无水乙醇，使L-丝氨酸结晶，最后 离心烘干可得产品267kg/天。年操作日为300天。 • 简述: 717型离子交换树脂→装入离子交换罐→用氢氧化钠溶液 处理→上样→用去离子水洗涤→用Hcl溶液洗脱→浓缩→冷却→ 加入无水乙醇→结晶→离心过滤→烘干→产品
• 鉴于化学合成法和酶法各自的优势, 可将二者结合起来, 即先用化学 合成法制备出DL-丝氨酸, 将其氨基乙酰化, 再用固定化酶法进行拆分。 现用于氨基酸拆分的酶主要是氨基酰化酶, 通常将酶固定在DEAE- 葡 聚糖凝胶A -25、碘乙酰纤维素或聚丙烯胺凝胶上。将固定化酶均心 地装入柱内, 底物( 乙酰化氨基酸) 溶液在合适的柱温、pH 条件下以 一定的速度通过酶柱即可。过程如下：
VHcl 4V V
样品
放大
4 16510 66040L 16510L
V
放大
V水 6V
放大
6 16510 99060L 0.42 16510 6934L 0.58 16510 9576L
V丝 0.42V V
2017/4/8
放大
甘
0.58V
放大
成蛋白质的常见20种氨基酸中的一种，是哺乳动物的非必 需氨基酸，也是生酮氨基酸。在自然界中也有D-丝氨酸， 如丝原蛋白中。在一些抗生素中也有D-丝氨酸。符号： S。 学名：2-氨基-3羟基丙酸。 英文名：L-Serine ，缩写：L-Ser ， 分子式：C3H7NO3 ，结构式：CH2OHCH(NH2)COOH ，分子 量：105.09 。 结构式：
D 3.5m H 3D 10.5m
• 圆整得
• 浓缩罐设计 • 进料体积 ：6934T • 选择搪玻璃蒸发器10m3 HG5-38-79
• 冷却器
• • • • 假设冷却时间为0.5h,即t=0.5h 查表得 换热系数：K=830~1250kJ/(m2· h· ℃)取K=1000kJ/(m2· h· ℃) T t T3 t2 100 37 37 27 28.8C 对数平均温度 tm 2 1 T t ln 100 37 ln 2 1 m料Cp, m1T2 T3 tKAtm 37 27 T t
2017/4/8
• 2．在12 m3的发酵罐配料罐中加入8.35m3的LB培养基，开启搅 拌待混匀后，用泵打入发酵罐中，进行灭菌，用138℃水蒸气先 进行间接加热（使培养基从25℃升至90℃），再用蒸汽直接加 热（使培养基从90℃升至121℃），然后用冷却水使之冷却到 37℃，待用。 • 3.将种子罐中的料液放入发酵罐中发酵14h，再用离心机进行离 心分离，收集菌体，废液放入贮罐中。
• 物料衡算
• 已知柱子Φ25×500mm，一个柱子的体积为V，已知NaOH溶液 用量为4V，洗涤水用量为2V，洗涤液用量为4V，其中含氨基酸 的洗脱液体积为1V，含L-丝氨酸的洗脱液体积为0.42V。将含L丝氨酸的洗脱液浓缩液浓缩至原体积的1/10，加入3倍体积的无 水乙醇，将晶体（湿含量15%）离心烘干，L-丝氨酸的分离得率 为77%。年操作日300天。