梨黑斑病病原菌的生物学特性及其致病性观察

产孢量/ (个 ·mL - 1) Spore quantit y
5. 67 ×104 edf 9. 37 ×105 b 1. 83 ×106 a
3. 83 ×104 ef 5. 52 ×105 c 1. 47 ×106 de
1. 17 ×104 f 1. 55 ×105 de 1. 70 ×105 d
均生长速率为 0. 95 cm/ d ,菌株 C 日平均生长速率 2. 5 光照条件对病原菌的影响
为 0. 96 cm/ d ;3 个菌株在查氏培养基上日平均生长
1) 菌丝生长速率 。试验结果表明 :不同的光照
速率最慢 。
条件对供试病原菌菌丝的生长有显著影响 。A 菌株
菌株 A 在 PSA 和查氏培养基上均在第 6 天达 在第 1～4 天时 ,菌丝日生长速率差异不大 ,第 5 天
菌液准备 :洗出在 PSA 培养基上培养的菌株孢 子 ,用无菌水分别配成孢子悬浮液浓度为 2 ×105 个/ mL 。
取湘南梨的新梢顶端第 2～3 片完全展开的无 病虫害的叶片 ,用 0. 2 %的次氯酸钠和 75 %酒精表
面消毒各 5 s 后 ,再用无菌水冲洗干净 ,待用 。将配 置好的病原菌孢子悬浮液用喷雾法接种到叶片 ,以 清水喷雾叶片作对照 。置于 28 ℃恒温培养箱培养 , 14 d 后调查接种离体叶的发病情况 。每个处理 30 片叶 ,重复 3 次 。
到最快生长速率 ,第 7 天来自百度文库长速率下降 ,在 PDA 培 时菌丝在每隔 12 h 光暗交替条件下日生长速率变
养基上在第 5 天就达到生长高峰 ,第 6 天和第 7 天 大 ,随后 2 天又降低 ,光照 、黑暗和光暗交替 3 种培
生长速率显著下降 ; 菌株 C 在 3 种培养基上均在第 养条件下 的日 平 均 生 长 速 率 分 别 为 0. 91 cm/ d 、
关键词 梨黑斑病 ; 生物学特性 ; 致病性 ; 病情指数 中图法分类号 S 436. 612. 1 + 4 ; S 661. 2 文献标识码 A 文章编号 100022421 (2009) 0620680205
梨黑斑病又名裂果病 ,是梨的三大病害之一 ,由
自配面粉培养基 (flo ur medium) 的配方 : 锯屑
砂梨叶片 :采自位于湖北省武汉市江夏区的国 1. 4 不同时期孢子发芽率的观察
家果树种质武昌砂梨圃 ,品种为湘南 。
供试病原菌培养 2 周后 ,洗出菌株的孢子液 ,置
培养基 : PSA 培养基 、PDA 培养基和查氏培养 于 28 ℃恒温培养箱培养 ,分别于 0 h 、2 h 、4 h 、
基 (Czapek′s medium) ,培养基配方详见文献[ 7 ] 。 6 h 、8 h 、10 h 、12 h 、14 h 后观察并记录各菌株的
菌株 A 日平均生长速率为 0. 92 cm/ d ,菌株 H 日平
The data wit hin a column followed t he same letter are not significantly different at 5 % level (t he same as following tables)
将各供试菌株的菌丝块接种到 PSA 培养基上 , 置于连续光照 、连续黑暗及光照 12 h 与黑暗 12 h 交替条件下 ,每天同一时间测量菌落直径观察菌落 颜色及厚度 。培养 2 周后测量产孢量 。每处理重复 3 次。 1. 7 pH 值对孢子发芽率影响的观察
取 250 mL 锥 形瓶 , 装入 200 mL 蒸馏 水 , 用 1 mol/ L NaO H 和 0. 1 mol/ L H2 SO4 调 p H 值分别 至 1 、2 、3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 、10 、11 、12 、13 、14 , 高压灭菌 20 min 。然后分别将不同菌株的孢子液 2 mL 加入 不同 p H 值的锥形瓶中 ,摇匀后分别置于 28 ℃恒温 培养箱培养 ,6 h 后观察分生孢子发芽率 。每处理 重复 3 次 。 1. 8 病原菌致病性的测定
观察结果表明 :菌株 A 、菌株 C 和菌株 H 3 个 生长速率居中 ,为 1. 38 cm/ d ;产孢量最大的是菌株
供试菌株在 PSA 培养基上培养后 ,其日平均生长速 H ,为 1. 83 ×106 个/ mL ,产孢量最少的是菌株 A ,为
率 、菌落颜色 、产孢量及菌落厚度均有显著差异 。菌 5. 67 ×104 个/ mL ,菌株 C 的产孢量为 9. 37 ×105
图 1 A、H、C 3 个菌株在显微镜下的孢子形态 (10 ×40)
Fig. 1 The spore s of isolated three strains A ,H and C observed under the micro scope (10 ×40)
2. 2 菌株的生物学特性
日平均生长速率最小 ,为 0. 91 cm/ d ,菌株 C 日平均
(湖北省农业科学院果树茶叶研究所 ,武汉 430209 )
摘要 采用室内离体接种和室外孢子喷雾接种方法 ,对 3 株梨黑斑病病原菌的生物学特性和致病性进行了 观察 。结果表明 :供试各菌株在 PSA 培养基上培养 ,平均日生长速率 、产孢量 、菌落颜色及菌落厚度差异显著 ; 各病原菌菌株在光照 、黑暗和 12 h 光暗交替培养时 ,日生长速率和产孢量有明显差异 ;黑斑病病原菌最适生长 和产孢培养基为 PSA ;孢子萌发最适 p H 值 8～10 ; 菌株 A 和菌株 H 的致病力显著强于菌株 C ,但这 2 个菌株间 的致病性无显著差异 ; A 、C、H 3 种菌株混合接种时 ,可使梨叶片表现自然发病时的典型病斑 。
鸭梨 ,随后加拿大也采取了类似的暂停措施 ,给我国 的黑斑病病斑 。
鸭梨产业和出口企业造成严重威胁[6] 。目前 ,国内 1. 3 病原菌生长特性的观察
对于梨黑斑病原菌的生物学特性的研究较少 。为了
将分离获得的病原菌分别移植于 PSA 培养基
解梨黑斑病病原菌的特性 ,笔者对其生物学特性和 上 ,28 ℃保湿培养 2 周后 ,用打孔器 (直径 6 mm) 在
致病性进行了系统观察 ,旨在为梨黑斑病的防治和 菌落边缘打孔 ,再将菌丝块放置于新鲜的培养基上 。
抗病品种的筛选提供理论依据 。
28 ℃恒温培养箱光照条件下培养 。
1 材料与方法
每天同一时间测量菌落直径并观察和记载菌落 颜色及厚度 。培养 2 周后测量产孢量 。每处理重复
1. 1 供试材料
3 次。
观察结果表明 :在不同培养时间菌株孢子的发 芽率有显著不同 ,培养 6 h 时 ,A 、C、H 3 个菌株的 发芽率均能达到最高峰 ,其中菌株 A 发芽率最高达 84. 5 % , 菌 株 C 最 高 达 73. 3 % , 菌 株 H 达 到 85. 8 % ;8 h 和 10 h 计数时 ,孢子发芽率基本不变 ; 3 个菌株在不同时期的发芽趋势大体相同 。 2. 4 不同培养基对病原菌的影响
梨黑斑病主要危害叶 、果实和新梢 ,导致树体衰 1. 2 病原菌的分离
弱 ,结果年限缩短 ,并引起贮藏期果实发病 ,造成重
采集梨黑斑病叶片 ,按常规方法进行组织分离 、
大经济损失[425] 。2003 年底至 2004 年初 ,美国以中 单孢纯化 、培养 、保存 。根据柯赫氏法则将分离获得
国出口鸭梨上检出梨黑斑病新种为由暂停进口我国 的菌株接种到幼嫩的梨叶片上 ,观察能否产生典型
第 6 期
杨晓平 等 : 梨黑斑病病原菌的生物学特性及其致病性观察
681
孢子发芽率 。 1. 5 不同培养基菌丝生长和产孢量的观察
将各供试菌株的菌丝块分别移植于 PSA 培养 基 、PDA 培养基 、查氏培养基和面粉培养基上 ,置于 28 ℃恒温培养箱内光照条件下培养 。每天测量菌 落直径并观察记录菌落颜色及厚度 。培养 2 周后测 量产孢量 。每处理重复 3 次 。 1. 6 不同光照条件菌丝生长和产孢量的观察
2 结果与分析
2. 1 病原菌的鉴定 把分离获得的 11 株病原菌接种到幼嫩的健康
梨叶片上 ,其中 A 、C、H 3 个菌株能产生典型的黑斑 病病斑 。通过对产生的病斑进行再次分离 ,挑取单 孢纯化 ,可获得病原菌菌株 。
在显微镜下分别观察供试病原菌的形态特征 , 结果表明 :供试 3 个病原菌菌株的分生孢子梗单生 或数根束生 ,褐色或暗褐色 ; 分生孢子棒状或倒棒 状 ,褐色或黑褐色 ,有纵隔 1～3 个 ,横隔 2～4 个 ,横 隔处有缢缩现象 (图 1) 。根据供试病原菌的形态特 征和培养性状 ,鉴定该病原菌为半知菌亚门丝孢纲 丝孢目链格孢属真菌 。
株 H 日平均生长速率最大 ,为 1. 44 cm/ d ,菌株 A 个/ mL 。供试 3 个菌株的菌落颜色 、厚度均不同 :菌
68 2
华中农业大学学报
第 28 卷
株 A 菌落颜色较浅 ,呈灰色 ,菌落薄 ,气生菌丝密 ; 菌株 C 颜色较深 ,呈深绿色 ,菌落厚 ;菌株 H 颜色最 深 ,呈墨绿色 ,菌落厚 。 2. 3 培养时间对孢子发芽率的影响
1933 年 Tanaka 首次在日本报道梨黑斑病[1] ; 1999 验设备有限公司产品 ;生物显微镜 XSZ24 G ,重庆光
年 Baudry 在法国发现该病[2] ; 中国于 1935 年发现 电仪器有限公司产品 ; 血球计数板 XB2K225 ,上海
该病[3 ] 。
安信光学仪器制造有限公司产品 。
第 28 卷 第 6 期 2009 年 12 月
华 中 农 业 大 学 学 报 Journal of Huazhong Agricult ural University
Vol. 28 No . 6 Dec. 2009 ,680～684
梨黑斑病病原菌的生物学特性及其致病性观察 3
杨晓平 胡红菊 王友平 3 3 田 瑞 陈启亮 张靖国
田间接种在国家果树种质武昌砂梨圃进行 。采 用湘南嫁接苗 ,用供试孢子液喷雾 ,30 d 后每个处 理随机调查 300 片叶 ,并计算各处理的病情指数和 发病率 。
病情指数的分级标准和计算公式参见文献[ 8 ] 。 1. 9 数据处理
应用 SA S 8. 0 版本统计软件对试验数据进行 统计分析 。
表 1 不同培养基对 3 个菌株产孢量的影响1) Table 1 Effect of different medium to the spores
quantity of three strains
培养基 Medium
PSA
PDA
查氏 Czapek’s
菌株 St rain
A C H
A C H
A C H
收稿日期 :2009205206 ; 修回日期 :2009Ο06Ο05 3 国家科技基础条件平台项目 (2006D KA21002224) 、现代农业产业技术体系建设项目 ( nycyt xΟ29Ο23 、湖北农业科技创新专项资金 (2007Ο 620Ο005Ο03Ο03) 资助 3 3 通讯作者. E2mail : ypwang7485 @263. com 杨晓平 ,男 ,1981 年生 ,硕士 ,助理研究员. 工作单位 :湖北省农业科学院果树茶叶研究所 ,武汉 430209. E2mail : yangxiaoping1981 @163. com
真菌的链格孢菌 A lternari a alternate ( Fr . ) Keissl 200 g , 麦麸 150 g , 玉米面 100 g , 米面 25 g , 蔗糖
侵染引起 。该病是梨树上广泛发生的世界性病害 , 25 g , 水 625 mL 。
尤其 在 亚 洲 的 日 本 、韩 国 和 中 国 发 病 十 分 严 重 。 主要仪器 : 恒温培养箱 GZP2250 ,上海精宏试
1) 菌丝生长速率 。试验结果表明 :供试菌株在
A
不同培养基上的生长速率有明显差异 。其中 ,A 、C 、 面粉 Flour
C H
8. 33 ×104 def 8. 50 ×104 def 1. 45 ×105 de
H 3 个菌株在 PSA 培养基上日平均生长速率最快 。 1) 纵列数据后字母相同者 ,表示差异不显著 ( P > 0. 05 ,下表同)