植物中病毒诱导的基因沉默
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本实验用的载体的构建
植物转化：农杆菌注射法（agro-inocula来自百度文库ion）
植物转化：农杆菌注射法agro-inoculation
转化pCAPE1、pCAPE2-GFP保存的农杆菌液分别用 含有50ng/μL卡那霉素和100ng/μL利福平的LB 液体培养基培养过夜。 培养到OD=1.2-1.5时，取菌液加入到1.5mL离心 管中，离心，用含10mMNaCl、0.1mM乙酰丁香酮、 1.75mMCaCl2的培养基重悬，静置90min。 两种转化质粒的农杆菌等量混合。 注射植物。嫩叶用1mL注射器在远轴端挑叶背， 但不挑破，吸取制备好的菌液注射。
实验目的
构建适合不同植物（豆科）的VIGS载体
选用的病毒：Pea early browning virus (PEBV) 原因：1、与TRV同属 2、已建成带有GFP报告基因的表达载体
结果1、PEBV侵染克隆的构建
双元载体系统(binary vector system)
农杆菌介导的植物转化机理
VIGS应用的病毒和载体
烟草：烟草花叶病毒TMV 大麦：大麦条纹花叶病毒barley stripe
mosaic virus
拟南芥：卷心菜曲叶病毒 cabbage leaf curl
virus
番茄：烟草脆裂病毒tobacco rattle virus (TRV) 马铃薯：Potato virusX(PVX)
讨论
最广泛应用的病毒是PVX TRV VIGS应用还主要用于烟草。说明烟草感染效率 高，发展针对其它寄主的PEBV载体的难度。 农杆菌注射法的感染效率可达100%其高效性、 可靠性为应用作高通量研究打下基础。 N. benthamiana中 PVX 、TRV 载体引起的突 变4周后又恢复现象，导致沉默与回复表型共 存，相比之下PEBV引起的现象稳定。
植物中病毒诱导的基因沉默
刘同坤
VIGS病毒诱导基因沉默 VIGS病毒诱导基因沉默
植物病毒可用作蛋白质过表达和序
列特异的基因沉默的表达载体,两者 都是功能基因组学研究工具.
病毒诱导的基因沉默(VIGS)的获得
1.构建载体 目的基因替换病毒中的与病毒复制、运动无关 的基因 直接插入到病毒基因组中 2 植物的转化 农杆菌 3 病毒携带目的基因在植物中复制和传播
检测转化体系
21天后，在注射 叶子上面新长出 来的叶子上检测 到绿色荧光
说明转化体系成 功。
结果2、八氢番茄红素去饱和酶基因（PDS） 的沉默
PDS是产生类胡萝卜素的关键基因，沉默后产
生光漂白现象
PsPDS:P. sativum中的PDS基因
现象
RT-PCR检测PDS mRNA水平的变化
原理
RNAi 病毒复制过程中形成的双链RNA触发植物中 与之具有高度序列一致性的mRNA降解。 Dicer酶
优点：1、试验周期短 2、可以研究T-DNA标记的敲除突变体 和表达了沉默诱导基因的转化子中有致死表型 的基因 缺点：1、不易获得针对特异物种的病毒载体 2、感病表型可能与靶基因沉默表型混淆
植物转化：农杆菌注射法（agro-inocula来自百度文库ion）
植物转化：农杆菌注射法agro-inoculation
转化pCAPE1、pCAPE2-GFP保存的农杆菌液分别用 含有50ng/μL卡那霉素和100ng/μL利福平的LB 液体培养基培养过夜。 培养到OD=1.2-1.5时，取菌液加入到1.5mL离心 管中，离心，用含10mMNaCl、0.1mM乙酰丁香酮、 1.75mMCaCl2的培养基重悬，静置90min。 两种转化质粒的农杆菌等量混合。 注射植物。嫩叶用1mL注射器在远轴端挑叶背， 但不挑破，吸取制备好的菌液注射。
实验目的
构建适合不同植物（豆科）的VIGS载体
选用的病毒：Pea early browning virus (PEBV) 原因：1、与TRV同属 2、已建成带有GFP报告基因的表达载体
结果1、PEBV侵染克隆的构建
双元载体系统(binary vector system)
农杆菌介导的植物转化机理
VIGS应用的病毒和载体
烟草：烟草花叶病毒TMV 大麦：大麦条纹花叶病毒barley stripe
mosaic virus
拟南芥：卷心菜曲叶病毒 cabbage leaf curl
virus
番茄：烟草脆裂病毒tobacco rattle virus (TRV) 马铃薯：Potato virusX(PVX)
讨论
最广泛应用的病毒是PVX TRV VIGS应用还主要用于烟草。说明烟草感染效率 高，发展针对其它寄主的PEBV载体的难度。 农杆菌注射法的感染效率可达100%其高效性、 可靠性为应用作高通量研究打下基础。 N. benthamiana中 PVX 、TRV 载体引起的突 变4周后又恢复现象，导致沉默与回复表型共 存，相比之下PEBV引起的现象稳定。
植物中病毒诱导的基因沉默
刘同坤
VIGS病毒诱导基因沉默 VIGS病毒诱导基因沉默
植物病毒可用作蛋白质过表达和序
列特异的基因沉默的表达载体,两者 都是功能基因组学研究工具.
病毒诱导的基因沉默(VIGS)的获得
1.构建载体 目的基因替换病毒中的与病毒复制、运动无关 的基因 直接插入到病毒基因组中 2 植物的转化 农杆菌 3 病毒携带目的基因在植物中复制和传播
检测转化体系
21天后，在注射 叶子上面新长出 来的叶子上检测 到绿色荧光
说明转化体系成 功。
结果2、八氢番茄红素去饱和酶基因（PDS） 的沉默
PDS是产生类胡萝卜素的关键基因，沉默后产
生光漂白现象
PsPDS:P. sativum中的PDS基因
现象
RT-PCR检测PDS mRNA水平的变化
原理
RNAi 病毒复制过程中形成的双链RNA触发植物中 与之具有高度序列一致性的mRNA降解。 Dicer酶
优点：1、试验周期短 2、可以研究T-DNA标记的敲除突变体 和表达了沉默诱导基因的转化子中有致死表型 的基因 缺点：1、不易获得针对特异物种的病毒载体 2、感病表型可能与靶基因沉默表型混淆