大肠杆菌的接种培养及抗菌实验

大肠杆菌的接种培养及抗菌实验

一、培养基的制备

本次实验的主要抗菌是采用抗大肠杆菌，那么首先是做培养基。我们团队使用的培养基是牛肉膏蛋白胨固体培养基，其成分为：牛肉膏3g，蛋白胨 10g，Nacl5g，琼脂18g，水1000mL,PH7.4～7.6。

具体配置步骤：

1、称药品

首先称取氯化钠15g，将其倒入1000ml的大烧杯中。然后称取牛肉膏，牛肉膏是种粘附性很高的膏状物，所以放在表面皿中称取，称取后用事先准备好的10g的热水溶解后倒入盛有氯化钠的大烧杯中。蛋白胨是泛有淡黄色的肉粉，它极易吸潮，称量时需要很迅速，然后将其倒入上述的大烧杯中。称量琼脂18g，将其放在小烧杯中以待用。准备工作已经完成。

2、加热溶解

在上述准备的烧杯倒入少量的水，放在石棉网上，小火加热，并用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后，先将水补充到1000ml,再将已经准备好的琼脂放入大烧杯中，再继续加热融化，期间要用玻璃棒不停的搅拌，防止琼脂糊底或者溢出，最后补足缺失的水分。

3、调解PH值

检测培养基的PH值，我们团队制作的培养基PH在6.7，需要加1mol/l NaOH，共加10滴，又滴加1mol/l HCl 3滴，使PH到7.4。

4、制作棉塞

试管用普通棉花，制作的棉塞。棉塞的形状,大小和松紧度要合适,四周紧贴管壁,不留缝隙,才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内,以防棉塞脱落。

5、分装

根据本次实验要求,将配制的培养基分装入5支试管。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。

分装量:牛肉蛋白胨培养基约为试管高度的l/5。

6、加棉塞

将已经制作好的棉塞分别将已装好培养基的试管上。

7、包扎

由于培养基分装于试管中，将5支试管放在一起,再于棉塞外包一层牛皮纸,用绳扎好。然后用记号笔注明,培养基名称,组别,日期。

8、灭菌

将标记捆绑好的试管，放入蒸汽式高压锅中灭菌，温度一般可以达到160度左右，灭菌时间为2小时。

9、保存

将灭完菌的5支试管放入冰箱中保存。

二、大肠杆菌的接种及培养

接种的全部过程全部都是在无菌操作台上完成的。

1、将已经灭完菌的待用试管培养基和已经形成菌落的培养基放在无菌实验操作台上，然后点燃酒精灯，让其先燃烧着。

2、用酒精将手擦拭，并且将试验台也擦拭干净，清除可能会存在的杂菌，实现真正的无菌操作。

3、将接种环在酒精灯上燃烧，直至接种环被烧成红色的。

4、把已生长菌落的菌种试管放在酒精灯旁打开活塞，在酒精灯上灼烧一会，用接种环在培养基里取一点菌种，然后在酒精灯旁将活塞塞上，放置一边。

5、将已经准备好的待用培养基放在酒精灯旁打开棉塞，把接种环放进去用划线法将菌种接种上去，然后在酒精灯旁将棉塞塞上，放置一边。

6、重复上述步骤，将5支试管全部接种完。

7、最后再将5支已经接种完的试管重新用报纸包扎好，放在37度的培养箱中培养3天。

三、抗菌实验

1、将培养基倒入三角瓶中，150ml。再准备100ml的水倒入三角瓶中。

2、把上述的培养基、十支空培养皿和盛有100ml水的三角瓶放在高压锅培养基中灭菌2小时。

3、将事先已经被中草药提取物上染的棉织物剪成直径为1.5厘米的小圆块放在培养皿中，再放入烘干箱中进行灭菌，温度是95摄氏度，时间为2小时。

4、将灭完菌的三角瓶培养基中的培养基均匀倒入十支已经灭菌

的培养皿中，放在冰箱中保存。

5、在无菌台上把菌种接种在培养皿上，位置是培养皿的正中心，以划线法接种。

6、把之前灭完菌的的棉织物滴一点无菌水，然后用灭完菌的镊子将棉织物在烘箱内平铺在已经接种的培养皿的两侧。

7、重复以上步骤，将所有的棉织物都平铺完毕后，把所有的培养皿放在恒温37度的培养箱中培养3天，观察其生长情况。

8、由于织物吸附的提取液慢慢向四周扩散，因此在织物的周围就出现清晰的抑菌圈。抑菌圈的大小代表提取液抗菌力的高低，同种菌种不同药剂成分情况下，抑菌圈越大，抗菌能力提高。抑菌圈的抑菌范围用直径来表示。