细胞生物学的研究技术和方法

原代培养： 指直接从肌体获取组织或细胞后 立即进行的首次细胞培养。
传代培养：
当原代培养的细胞生长、增 殖达到一定密度后，从一个培养 器以一定比例分装或转移到另一 个或两个以上容器中所进行的再 次培养（传一次称为一代）。
细胞培养技术是细胞生物学中最基本、最 常用的一项实验技术，细胞大量生理、生化数 据以及功能活动资料大多由它而获得。
核(或拟核)的原生质所组成
是生物体结构和功能的基本单位 是生命活动的基本单元
研究内容 ：
细胞各组分：膜、质、器、核等
结构和功能以及相互关系。 细胞整体和动态的功能活动：
发育、分裂、分化、遗传、变异、
衰老、死亡等 及其调控。
研究任务 ：
通过对细胞各组分、细胞整体 和动态的功能活动的研究，阐明细 胞各种生命活动的本质和规律。
一、形态结构观察
（一）显微结构（microscopic structure ）
——光镜下所见的细胞结构 1、普通光镜 分辨力—显微镜或人眼在25cm 的明视距离处能够区分相近两点间最 小距离的能力。
人肉眼分辨力：
100 μm
人卵细胞
光镜最大分辨力： 0.2 μm
2、相差显微镜
观察活细胞（倒置相差显微镜）
（a) ：Hela 细胞
（b) ：中国地鼠卵巢细胞
（二）细胞融合技术
细胞融合:
指细胞彼此接触时，两个或两个以
上的细胞合并形成一个细胞的现象。 细胞融合的结果： 含两个不同亲本细胞核的细胞 异核体
含同一亲本细胞核的细胞
同核体
自然融合 人工诱导融合（生物、物理、化学） 细胞融合技术是研究细胞遗传、 细胞免疫、肿瘤等的重要手段，尤 其对单克隆抗体的产生开拓了一条 新的途径。
物等进行定性、定位、定量研究。
2、荧光细胞化学技术
原理：用荧光色素对细胞进 行染色，在荧光显微镜下观察细 胞中的荧光现象（研究对象同上， 但特异性比一般细胞化学技术强，
灵敏度高）。
3、放射自显影技术
通过跟踪被放射性同位素标记 的生物大分子或其前体物质的代谢 过程，在不破坏组织和细胞结构的 情况下，研究机体和细胞代谢状态 和动态变化的过程。 能揭示细胞分子水平的动态变化。
复 习 思 考 题 1、总结已学习过的各种显微镜的主要用途 2、细胞化学法的原理及应用 3、怎样获取细胞的不同组分 4、两个不同亲本的细胞融合后可能得到哪 两种类型的细胞 5、电镜下我们是怎样认识细胞结构的
基础理论
（二）现代医学重要课题的研究将依
赖于细胞生物学的更深入的发展
如肿瘤发生的机制、治疗
（三）细胞生物学的研究成果应用于医学实践 如干细胞的研究
1996 年 7 月 5 日 ， 世界上第一只克隆 羊“多利”在英国 苏格兰卢斯林研究 所（伊恩博士）的 试验基地诞生。
干细胞研究不仅为基础生 物学研究开辟了新领域,还 将为多种疾病的治疗新的 思路和手段
3、暗视野显微镜 观察活细胞内细胞器以及 液体介质中的细菌和真菌等 特点: 反差大、分辨力高（0. 04μ m), 但不能分辨内部微细结构
4、荧光显微镜
对细胞中的荧光物质进行定性、 定位观察（可检测蛋白质、核酸）。 光源—紫外线 自发荧光:VitA、核黄素、叶绿素等 诱发荧光: 丫啶橙 DNA 黄色
特点：
分辨力高，可观察厚切片（1μ m）
二、细胞组分的测定（P27 ）及分离 （一）测定
1、细胞化学技术
保持细胞完整结构的基础上，
利用某些化学物质可与细胞内某
种成分发生化学反应，在局部范
围内形成有色沉淀（或电子密度
高的物质）的原理，对细胞的化
学成分进行定性、定位和定量的
研究。
可对蛋白质（酶）、核酸、碳水化合
细胞生物学的研 究技术和方法
本章内容提要
一、细胞生物学概念 二、细胞生物学与医学 三、细胞生物学发展简史
一、细胞生物学
（cell biology）
利用现代物理、化学技术和 分子生物学方法，从细胞整 体、亚显微结构、分子水平 来研究细胞生命活动基本规
律的科学。
研究对象：细胞
?
细胞（cell）是由膜包围着含有细胞
形态 生理功能、生物化学、遗传发育机理
（细胞培养技术、电子显微镜） （五）细胞生物学阶段
始于20世纪60年代
细胞生物学今后的发展方向
从细胞与分子的角度研究：
基因的结构、表达与调控
细胞内的信号转导
细胞结构体系的组装 细胞增殖、分化、凋亡的相互关系 及其调控等。
分子细胞生物学
（molecular cell biology）
单克隆抗体技术
B淋巴细胞能分泌特异抗体，但不能长期培养， 瘤细胞可以在体外长期培养，但不分泌特异抗 体。于是Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂 交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔 奖。
HAT:hypoxanthine，aminopterin，thymidine
（三）核酸分子杂交技术 P32
（二）细胞学说创立阶段
19世纪初叶—19世纪中叶
Matthias Jacob Schleiden Theodar Schwann
细胞学说 （cell theory） 一切生物，从 单细胞到高等动物 和植物都是由细胞 组成的，细胞是生 物形态结构和功能 活动的基本单位。
（三）经典细胞学阶段 19世纪中叶—20世纪初叶 细胞核及其在分裂时的变化 有丝分裂、减数分裂 中心体、线粒体、高尔基复合体 （四）实验细胞学阶段 20世纪初叶—20世纪中叶
进一步利用和控制细胞活动 的现象和规律，达到造福于人类的 目的。
为什么要把细胞 单独作为一门学 科进行研究？
为什么要从 三个层次来 研究细胞？
细胞内具有 高度有序且为动态的结构体系： 遗传信息结构体系 膜结构体系
细胞骨架结构体系
分子复合物 三大结构体系
细胞 生物体
二、细胞生物学与医学
（一）细胞生物学是现Leabharlann Baidu医学的重要
利用碱基互补原则使两条核 酸单链形成双链杂交分子，该过 程称核酸分子杂交。应用此原理 检查两种核酸分子碱基排列的互 补程度称核酸分子杂交技术。
细胞原位分子杂交技术：
使细胞中DNA或RNA在保持原
来位置条件下进行的分子杂交。可
对所用材料中被杂交的DNA分子进 行定位、定量分析以及基因表达水 平的观察。
复 习 思 考 题
1、根据细胞生物学研究的内容与你所
掌握的知识，谈谈医学生学习细胞
生物学的必要性，并举例说明细胞
生物学与医学的密切关系
2、细胞生物学是一门什么样的学科
3、阐述细胞、细胞学说的内容
第二章 细胞生物学的研究技术和方法 本 章 内 容 提 要 一、形态结构研究：显微结构、亚微结构 二、细胞组分的测定及分离： 细胞化学技术、放射自显影技术、细 胞组分的分级分离 三、其他实验技术： 细胞培养技术、细胞融合技术、细胞 原位分子杂交技术
三、细胞生物学发展历史
（一）萌芽阶段
17世纪中叶—19世纪初叶
1665年Robert Hooke ： Cell
cell
Made by A.van Leeuwenhoek (1632-1723).
Magnification ranges at 50-275x.
1675年:原生动物、RBC、精子
根据细胞内各种结构的比重和大 小不同，而致在同一离心场内沉降 速度也不相同的原理。
① 差速离心
② 密度梯度离心
差 速 离 心
密度梯度离心
3、分析—用细胞化学法等鉴定得到的组分
三、其它实验技术 （一）细胞培养技术 P21 细胞培养：在无菌条件下， 从活体中取出的细胞或其它建系 细胞，在模拟体内正常生理环境 情况下，使之能继续生存、生长、 增殖的一种方法。
RNA 绿色
罗达明—蛋白质
蓝色荧光示DNA；绿色荧光示微管
（二）细胞的亚微结构 亚微结构（submicroscopic structure） ——指细胞内小于0.2 μm的 微细结构 1、透射电子显微镜（TEM） 观察细胞内部细微结构 特 点：平面图象 分辨力：0. 08 nm
2、扫描电子显微镜（SEM） 观察样品（细胞）表面形貌 特 点：立体图象 分辨力： 3 nm
Figure 3-32. Cells in culture. Scanning electron micrograph of rat fibroblasts growing on the plastic surface of a tissue-culture dish.
3、高压电子显微镜（HEM） 电镜电子束加速电压： 120KV以下—常规EM 120KV以上—高压EM 500KV以上—超高压EM
放射性同位素（3H 、32P 、125I等） ↓ H 标记生物分子或其前体物质 ↓ 胸腺嘧啶 核苷酸 引入细胞或机体中 ↓ 取组织制片 ↓ 感光 ↓ 分析
3
（二）细胞组分的分离（P23）
包括细胞各种结构和各化学组分的分离。
细胞分级分离法——细胞各种结构的分离
组织细胞匀浆
分级分离 分析
1、组织细胞匀浆—机械性研磨细胞 2、分级分离