RNA干扰技术原理及应用

（5） siRNA表达框架
siRNA 表 达 框 架 (siRNA expression cassettes ， SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，能够直 接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。 这 个 方 法 最 早 是 由 Castanotto 采 用 ， 包 括 一 个 RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III 终止位点。 和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、 测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用 一天的时间。 因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以 用来筛选在特定的研究体系中启动子和RNA表达框架
如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选 出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建 siRNA表达载体。 构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的 研究。
（3）用RNase III 消化长片断双链 RNA制备siRNA
dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有 效siRNA序列的步骤 ，为研究人员节省时间和金钱 （注意：通常用RNAse III比用Dicer要便宜）。 不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特 异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。 现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响(1-4)。 最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表 型 不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定 的siRNA进行研究，特别是基因治疗
这个方法是选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模 版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然 后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一众 siRNAs“混合鸡尾酒”。 在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物 就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。 由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能 够保证目的基因被有效地抑制。
（2）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小 鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列 /EST同源的序列。例如使用BLAST
（3）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要 设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
负对照
一个完整的siRNA实验应该有负对照。 作 为 负 对 照 的 siRNA 应 该 和 选 中 的 siRNA 序 列 有 相 同 的 组 成 ， 但 是 和 mRNA没有明显的同源性。 通常的做法是将选中的siRNA序列打乱， 同样要检查结果以保证它和其他基因没 有同源性。
一般设计原则
（1）从mRNA 的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序 列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA 靶位点。有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的 siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。
Tuschl 等 建 议 不 要 针 对 5' 和 3' 端 的 非 编 码 区 （untranslated regions，UTRs）。这些地方有丰富 的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起 始 复 合 物 可 能 会 影 响 siRNP 核 酸 内 切 酶 复 合 物 结 合 mRNA从而影响siRNA的效果。
开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于siRNA表达，其优势在 于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒 转染效率低而带来的种种不便。 最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基 因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。 不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序 等较为费时、繁琐的工作）
该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference， 简称RNAi）。
RNAi广泛存在于自然界
随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南 芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核 生物中。 这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进 化的早期阶段。 随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐 步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的 有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。
2、siRNA 的设计
何为siRNAs
越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNA （small interfering RNAs，siRNAs）来抑 制特定的哺乳动物基因表达。 siRNA即为能够以同源互补序列的mRNA为靶 目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片断 双链RNA分子。 如 何 设 计 有 效 的 siRNA 一 直 是 当 前 RNAi 研 究 的热点话题，不同的实验室有不同的结果。
（2）体外转录
相对化学合成法而言成本比较低，是一种性价比高的 筛选siRNAs的好方法。 更重要的是能够更快的得到siRNAs。 值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓 度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果。 不足之处：实验的规模受到限制，虽然一次体外转录 合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应 规模和量始终有一定的限制。 最 适 用 于 ： 筛 选 siRNAs ， 特 别 是 需 要 制 备 多 种 siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。 不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长 期研究。
3、制备siRNAs的方 法
（1）化学合成
尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的—— 研究人员几乎不需要做什么工作。许多公司都可以根 据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。 主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊 需求的。 由 于 价 格 比 其 他 方 法 高 ， 为 一 个 基 因 合 成 3—4 对 siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他 方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。 最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要 大量siRNA进行研究； 不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是 价格因素
HeLa cells expressing cycle 3 GFP were transfected with pSilencer 2.1-U6 hygro containing an insert encoding an siRNA targeting cycle 3 GFP or pSilencer 2.1-U6 hygro without an siRNA-encoding insert.
Figure. Use of Chemically Synthesized and in Vitro Transcribed siRNAs targeting ß-Actin to Induce Gene Silencing.
（3）用RNase III 消化长片断双链
RNA制备siRNA
其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个 siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。 这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡 尾酒” 就可以避免这个缺陷。
➢ 之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中 表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U 来终止转录的。
➢ 使用这类载体，需要2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退 火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。
➢ 由于涉及到克隆，这个过程需 要几天的时间，同时也需要经 过测序以保证克隆的序列是正 确的。
RNAi作用的简单模型
当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内 切酶识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片 段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为 模板识别目的mRNA。
识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原 先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复 合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位 置。
核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了 21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合 物，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉 默，产生RNAi现象。
通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到 RDE-2,RDE-3和Mut-7等RNAi相关的基因。
RNAi研究的一般技术路线
Following transfection, the cells were selected with hygromycin. Three weeks following selection, the cells were analyzed for GFP expression by fluorescence microscopy. Green: GFP. Blue: DAPI stained nuclei. GFP levels were remarkably reduced (94%) in cells transfected with the GFP siRNA-encoding pSilencer 2.1-U6 hygro siRNA Expression Vector as compared to those transfected with an "empty" siRNA expression vector.
1、RNAi 机制
体外实验结果的提示
体外实验表明：RNAi反应中，加入的dsRNA被切割 为21-23核苷酸长的RNA片段，后者会使目的mRNA 被切割为21-23核苷酸长的片段。 从已经发生RNAi的果蝇S2细胞中，Hammond等人部 分纯化了一种核酸酶，该核酸酶具有序列特异性，它 仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。 那么这种核酸酶是如何确定哪些mRNA该降解而哪些 不该呢？ 由于在纯化该核酸酶时，可以共分离出21-23核苷酸长 的dsRNA片段，这暗示该核酸酶对mRNA的切割有可 能是以这些片段作模板指导进行的。根据以上的实验 结果，人们提出一种RNAi作用的简单模型。
RNAi的提出
直到1998年2月，Fire A和Mello C才首次揭开这个悬 疑之谜。
他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时 发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的 双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基 因的表达。
他们证实，Guo S博士遇到的正义RNA抑制基因表 达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的 阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双 链RNA而引起。
RNAi的发现
1995年，Guo S等试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因的表达。
设计： 反义RNA 特异性地阻断par-1基因的表达； 正义RNA 以期观察到基因表达的增强。
结果: 二者都同样地切断了par-1基因的表达途
径。这是与传统上对反义RNA技术的解释不相 符合。该研究小组一直没能给这个意外以合理 解释。
➢ 不过幸好载体容易大量扩增， 这个优点足以弥补所有缺陷， 特别是当载体在实验中确实有 效的时候。
（4）siRNA表达载体
毫无疑问，siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以 进行长期研究的方法——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持 续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。 即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选，也有助于 富集带质粒的细胞。这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转 染效率低造成的问题。
Ku-70 levels were reduced 86% in cells transfected with the siRNA cocktail, compared to non-transfected controls.
（4）siRNA表达载体
➢ 多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中 的一种，操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。 包括的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。