鱼精蛋白

2011年10月12日，多地“救心药”鱼精蛋白紧缺的消息引起各方面关注。

鱼精蛋白来源的紧缺、利润空间小导致生产厂家越来越少，现在只有上海医药旗下的上海第一生化药业有限公司生产。

然而鱼精蛋白的需求一直较大，这种供需矛盾使得很多心脏手术无法进行。

鱼精蛋白是一种多聚阳离子肽，主要存在于各类动物成熟的精巢组织中，与DNA紧密结合在一起。

其分子量小，通常在一万以下，大约为4070道尔顿，一般由30个左右的氨基酸组成，其中2/3以上都是精氨酸，等电点为10~12，可溶于水和稀酸，加热不凝固。

按其氨基酸的组成，这些鱼精蛋白大致分为以下三类：（1）单鱼精蛋白（Monoprotamine）:碱性氨基酸只有精氨酸一种，这一类有鲱精蛋白、鲭鱼的鲭精蛋白，虹鳟鱼的精蛋白等；（2）双鱼精蛋白（Diprotamine）:碱性氨基酸含有精氨酸和组氨酸与赖氨酸的一种，这一类有鲤鱼的鲤精蛋白；（3）三精蛋白：此类鱼精蛋白含有全部3种碱性氨基酸，如鲟精蛋白。

使用美国国立生物技术信息中心（NCBI）的核心检索系统对蛋白质序列数据库进行鱼精蛋白序列检索，检索结果来源于鱼类。

用软件对天然鱼精蛋白序列进行比对，得到其保守氨基酸残基序列。

比对结果见图1.
由此看出，完全相同氨基酸残基序列为：-RRRR-SSSRP-RRRR-R-----RRRR---RRRR，即图中最后一个序列。

通过多重序列完全比对得到鱼精蛋白的保守序列是：X1RRRRSSSRPX2RRRRX3X4RX5X6X7X8RRRRGGRRRR.
自1937年McClean报道了鱼精蛋白鱼油抑菌活性以来，Miller等于1942年，Negroni 和Fisher等于1944年研究发现鱼精蛋白具有阻止细菌生长的作用。

之后鱼精蛋白受到越来越多的关注。

鱼精蛋白不仅具有促使细胞发育繁殖的作用，而且一旦将其分离出来，就能有效抑制多种食品腐败菌的生长和繁殖，同时，它还具有降血压、促消化、抗菌消毒、抑制肿瘤生长、治疗糖尿病等多重作用。

在医学领域里，鱼精蛋白也得到了广泛应用，它可延迟或阻止胰岛素释放，或作为肝素解毒剂等。

鱼精蛋白作为一种食品防腐剂，因其具有很高的安全卫生性，日益受到食品加工业的青睐。

鱼精蛋白具有多方面的作用，可应用于较多领域中。

本文主要从一下几个方面具体介绍鱼精蛋白的生理药理活性：
1.鱼精蛋白的抑菌作用。

鱼精蛋白具有广谱抑菌活性，能抑制枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌的生长，对革兰氏阳性菌、酵母、霉菌也具有明显抑制效果。

鱼精蛋白还能抑制好气性细
菌孢子发芽后的发育，若与加热灭菌法并用，则效果更好，而且能有效地抑制肉毒梭状芽孢杆菌中的A型、B型及E型菌的发育。

鱼精蛋白以游离型和盐类型两种形式存在，游离型的抗菌效果比盐类型更显著，但稳定性不如后者，因而在高温处理时盐类型的活性比游离型高。

纵观国内外的有关研究，根据鱼精蛋白作用于细菌细胞的部位不同，大致可认为存在2种机理：○1鱼精蛋白作用于细菌细胞壁。

钟立人等研究认为：鱼精蛋白主要是以分子中多聚精氨酸或多聚精氨酸与其它少数几个氨基酸以某种结构或形式和细菌细胞壁结合，破坏了细胞壁的合成以达到其抑菌效果。

○2作用于细菌细胞质膜。

Arden等认为：细菌细胞质膜是鱼精蛋白的攻击对象，鱼精蛋白是通过影响细胞质膜的功能来达到其抑菌效果的。

实验证明，鱼精蛋白对细胞质膜的影响主要是鱼精蛋白可影响细胞质子动力来影响氨基酸的吸收并因此降低细胞内ATP的含量以影响细菌细胞的能量转换；可作用于细菌细胞质膜来阻止细胞的蛋白质合成，但是鱼精蛋白不影响核糖体上蛋白质合成过程；鱼精蛋白破坏敏感细胞外膜的结构，造成细胞质浓缩，引起呼吸抑制；鱼精蛋白还通过其分子表面的高正电荷与细菌表面的负电荷的静电作用，破坏细胞膜，导致胞内成分的渗漏（如K+、ATP和细胞内的酶），从而使细菌代谢活性降低甚至死亡。

鱼精蛋白的抑菌特性会受温度、时间、pH、金属离子、有机成分以及菌种及其生长状况的影响。

2.鱼精蛋白抑制血管内皮生长因子表达，治疗糖尿病视网膜病变。

糖尿病视网膜新生血管出现的诱因是缺氧。

实验证明，鱼精蛋白对正常及缺氧条件下的RF/6A的VEGF表达均有明确的抑制作用，减少了VEGF与VEGFR的结合。

这有两种可能：鱼精蛋白抑制了VEGF与其受体结合；鱼精蛋白抑制了VEGF受体的表达，从而减少了两者的结合。

鱼精蛋白在缺氧状态下的这一作用，有着重要意义。

因为在活体，血管内皮细胞周围有各种组织细胞，鱼精蛋白被证实可以抑制血管内皮细胞自身合成的VEGF，但不意味着能够抑制其他所有细胞合成和分泌VEGF，所以血管内皮细胞周围可能还有一定高质量浓度的VEGF。

但若是鱼精蛋白可以抑制VEGF与受体结合，那么其必然会抑制所有来源的VEGF的传导通路在血管内皮细胞的启动，从而在活体发挥明确的作用。

而且Taylor等研究发现，鱼精蛋白对血管肿瘤的形成有抑制作用，能够抑制血管炎症的发生，还可以抑制血管肿瘤周围血管的增生。

3.鱼精蛋白是多阳离子强碱性多肽，可与肝素的葡萄糖胺聚糖结合，形成稳定的复合物，
抑制抗凝血酶Ⅲ的活性，从而对抗肝素的抗凝作用，起到止血的功效。

鱼精蛋白的这一作用在心脏直视手术和心导管介入治疗中有较大应用。

但临床发现，鱼精蛋白在手术中有不良反应发生。

鱼精蛋白可不同程度的降低心输出量和每博输出量，随着鱼精蛋白浓度的增高，心肌收缩功能呈浓度依赖性的降低。

而且鱼精蛋白及其肝素混合物对体循环血管都有内皮依赖性的舒张作用。

进入肺循环后，还可刺激肥大细胞释放组胺等血管活性物质，使肺血管收缩产生肺动脉高压，右心室负荷加重。

由于这些毒性反应，鱼精蛋白在临床中不良反应的应对措施的研究也得到了较大进展。

4.可延长胰岛素等药物的作用时间。

有研究表明，较高浓度的酪蛋白和鱼精蛋白能较好地抑制酶对胰岛素（INS）的降解，增加INS制剂的口服降血糖作用强度和时间，提高INS的口服生物利用度。

此外，鱼精蛋白还可与抗菌素、肾上腺皮质激素等药物形成混合物，以延长其疗效。

5.鱼精蛋白可治疗男性不育症。

鱼精蛋白中精氨酸最多，而精氨酸具有强化肝功能，解除疲劳，刺激垂体释放促性腺激素的作用，可治疗因精液分泌不足和精子缺乏引起的男性不育症。

而DNA具有抗
衰老、增强机体抵抗力、强化生殖功能的作用。

此外，鱼精中含有较多的微量元素锌，可使血浆睾酮水平与精子数目成倍增加。

可见，鱼精蛋白中以上三种物质的协同作用为开发治疗因精液质量下降、精子活动能力减弱、精子畸形率增高而引起的男性不育症的新药开辟了新的药物资源。

6.作为非病毒载体应用于基因治疗中。

鱼精蛋白是近年来发展起来的又一新型的天然高分子非病毒载体，与合唱高分子非病毒载体相比，以鱼精蛋白为聚阳离子对DNA进行缩合，不仅能使DNA伸展的长链得以压缩，提高其抵抗剧烈外力的能力，而且制备工艺简单、细胞毒性小、对pDNA 包裹能力高，能增强基因的体内外转染效率。

鱼精蛋白/DNA复合物，将是基因治疗临床应用中一种更具前景的载体系统。

由于技术问题，鱼精蛋白现阶段的生产主要是从鱼的精巢中提取，但通过提取方法得到的鱼精蛋白实际是鱼精蛋白的粗品，还含有其他物质如核酸、杂蛋白等，需要进一步纯化，得到初始产物，然后再作为原料药生产各种具体药物。

鱼精蛋白的提取无论是过去还是现代的办法，基本上是以硫酸或盐酸为主要提取剂，以柠檬酸或有机溶剂为纯化剂。

在最近几年中，鱼精蛋白的提取工艺有了较大的改进和简化，尤其是日本。

如制备鱼精蛋白盐类的方法中，有将鱼精蛋白在稀硫酸溶液中处理，抽取出鱼精蛋白及混杂蛋白。

然后再抽出液中加入甲醇或乙醇等有机溶剂沉淀上述蛋白。

也有在硫酸或盐酸抽出液中，不用有机溶剂而用聚磷酸盐，是鱼精蛋白以磷酸盐形式沉淀出来，然后将沉淀溶解在高浓度的硫酸铵中，复分解为精蛋白硫酸盐。

这些方法需中途取出再溶解，不利于操作的连续性。

在国内，谢俊杰等利用NaCl沉淀、硫酸酸解和三氯乙酸（TCA）沉淀等三步操作提取鲢鱼精蛋白。

徐明生等人也是用NaCl沉淀、硫酸提取，不过是采用冷乙醇沉淀和丙酮乙醚洗涤蛋白等。

畅天狮等人通过采用AOT/异辛烷体系萃取鲑鱼鱼精蛋白，萃取水相pH=8.0，0.1mol/L NaCl，蛋白浓度1mg/mL，反胶团相采用50mmol/L AOT/异辛烷，萃取率接近100%。

但反萃过程相对困难，反萃水相加入异丙醇后，可显著强化反萃过程。

鱼精蛋白的纯化技术主要是利用鱼精蛋白的电荷和分子大小，一般采用Sephadex 葡萄糖凝胶层析、离子交换层析等生化技术手段进行纯化蛋白，然后通过反相高效液相色谱( RP －HPLC)和SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鱼精蛋白纯度及组分的鉴定。

在聚丙烯酰胺等电聚焦过程中，因鱼精蛋白是带正电荷的碱性蛋白质，所以聚集于碱性端，而处在中、酸性区域的蛋白质条带则为杂蛋白。

聚丙烯酰胺等电聚焦完毕后，取胶板的碱性端，经扩散洗脱、透析除盐，然后进行凝胶过滤层析。

当鱼精蛋白粗提物通过凝胶过滤柱时，溶液中的物质就按照不同分子量筛分开来，鱼精蛋白分子小，能够进入凝胶孔内，所以最后被洗脱出来。

当然，也可以用制备型高效液相色谱作进一步蛋白纯化，通过等电聚焦电泳、质谱等方法测定蛋白质的等电点和分子量。

另外还可通过对鱼精蛋白序列进行人工改造，提高鱼精蛋白的生理药理活性。

例如，王威等通过分析非保守位点的氨基酸残基的重要性，对天然鲑鱼精蛋白序列进行人工改造，将天然序列中的21、22位Arg替换为Scr，获得一个新的序列（PRRRRSSSRPVRRRRRPR VSSSRRRRGGRRRR）。

尽管降低了鲑鱼精蛋白序列的两个正电荷，但是新序列的C端增加了一个丝氨酸簇，其对四联球菌抑菌活性稍有增加，同时扩大了对G-细菌的抑菌谱，且受pH的影响较鲑鱼精蛋白硫酸盐小，与鱼精蛋白硫酸盐具有同样的热稳定性。

现在市场上含有鱼精蛋白的药物主要有以下几种：硫酸鱼精蛋白注射液、高鱼精蛋白锌胰岛素、中性鱼精蛋白胰岛素等。

其中，硫酸鱼精蛋白注射液为硫酸鱼精蛋白加氯化钠使成等渗的灭菌水溶液，是抗肝素药，用于因注射肝素过量引起的出血。

高鱼精蛋白锌胰岛素和中性鱼精蛋白胰岛素都是治疗中、轻度糖尿病的药物，重症需与正规胰岛素合用，有利于减少每天胰岛素注射次数，控制夜间高血糖。

下面从中山市康乃馨、欣生物医疗科技有限公司申请的发明专利鱼精蛋白复配制剂及其制备方法和应用（申请号：201110333714.0）来介绍鱼精蛋白药物的一种生产工艺。

在该发明中，公开了鱼精蛋白复配制剂及其制备方法和应用，该复配制剂可由鱼精蛋白、壳聚糖单独制得，也可以与甘氨酸、醋酸钠、单甘油酯、醋酸、无水酒精、溶葡萄糖球菌酶、溶菌酶、抑菌肽、灭菌蒸馏水中的一种或两种以上的混合物复配制得。

鱼精蛋白复配制剂的制备方法：在无菌或洁净车间按比例准确称取各组分，放入洁净玻璃或不锈钢中搅拌均匀，封装入无菌容器中即可。

该产品不仅有效杀灭金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、淋球菌、厌氧菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、肺炎双球菌、D群肠球菌、四联球菌、产单核李斯特菌、嗜麦芽窄食单孢菌、胃幽门螺旋杆菌等革兰氏阳性菌性及革兰氏阴性菌均有杀灭作用。

其具体实施方式较多，针对不同的抑、杀菌要求和使用方便，从不同的混合物成分和成分比例出发，可具体配置成无色透明的鱼精蛋白复配制剂和生物复合抗菌粉剂两种形式的15种具体示例。

下面就其中两种予以介绍。

实施例一：
配比：鱼精蛋白0.3%，水溶性壳聚糖1.9%，甘氨酸1.1%，单甘油酯0.5%，醋酸钠0.1%，醋酸0.1%，灭菌蒸馏水96%。

方法：在无菌室或超净工作台中，将以上试剂准确的称量，鱼精蛋白0.3g、水溶性壳聚糖1.9g、甘氨酸1.1g、单甘油酯0.5g、醋酸钠0.1g、醋酸0.1g、灭菌蒸馏水96ml（96g），放入洁净的玻璃或不锈钢盛具中，轻轻搅拌，充分混合均匀后，封装入无菌容器内即可。

应用：该配比可用于制造皮肤黏膜杀菌消毒剂，可在2~10分钟内杀灭皮肤、粘膜表面的金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌，杀灭率达99.8%。

可治疗脓肿、皮癣、溃疡、褥疮、烫伤、灼伤、疖、口腔溃疡、割伤、阴道炎、各类细菌感染引起的口腔疾病、预防性病，用于外科、泌尿科、口腔科、妇产科、耳鼻喉科等各种外科手术中术前术后的清创和伤口包扎。

实施例二：
配比：鱼精蛋白0.01%，水溶性壳聚糖10%，甘氨酸10%，单甘油酯0.1%，醋酸钠2.89%，醋酸10%，灭菌蒸馏水67%。

方法：在无菌室或超净工作台中将10g醋酸放入洁净的玻璃或不锈钢盛具中，加入灭菌蒸馏水67ml，轻轻搅拌，充分混合均匀后，再加入10g水溶性壳聚糖混匀后，加入鱼精蛋白0.01g、甘氨酸10g、单甘油酯0.1g、醋酸钠2.89g，充分混合均匀，封装入无菌容器内即可。

鱼精蛋白虽然是价值较低的各类动物的成熟精巢组织，尤其是鱼类精巢，但从经济角度来看，可实际利用的鱼类并不多，而且鱼精蛋白的提取、纯化过程也较为复杂，是非终端的灭菌产品，使得鱼精蛋白的供应有限。

因而寻找一种新的生产途径来提高鱼精蛋白的产量、降低其成本势在必行。

目前人们正在尝试通过基因工程在微生物中以融合蛋白质的形式表达抗菌肽基因，但仍有表达产物少的问题。

随着生物工程和基因工程的发展，人们对生物技术药物的生产研究必将得到快速发展。

鱼精蛋白作为目前医药行业中必不可少的药物之一，作为日渐兴起的食品保鲜和保健品中的新星，从传统的提取纯化工艺转为基因工程生产将显著降低成本。

但这依赖于其核酸修饰和微生物基因整合以至可大规模生产的进一步研究。

期待这一天的早日到来。