精蛋白锌胰岛素注射液中硫酸鱼精蛋白含量测定的方法研究
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药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012，32（ 4）
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精蛋白锌胰岛素注射液中硫酸鱼精蛋白含量测定的方法研究*
丁晓丽1 ，宋敏2 ，张慧1 ，梁成罡1＊＊
（ 1． 中国食品药品检定研究院，北京 100050； 2． 武汉市药品检验所，武汉 430012）
摘要 目的： 建立高效液相色谱（ HPLC） 法测定精蛋白锌胰岛素注射液中硫酸鱼精蛋白的含量。方法： 采用 Grace Vydac C18 色 谱柱（ 250 mm × 4. 6 mm，5 μm） ，以 A： 乙腈 － 0. 2 mol·L －1 硫酸钠溶液（ 4∶ 96） ； B： 乙腈 － 水（ 50∶ 50） 为流动相进行梯度洗脱（ 0 ～ 8 min 时 B0% →70% ，8 ～ 15 min 时 B70% ，15 ～ 16 min 时 B70% →0% ，16 ～ 30 min 时 B0% ） ； 流速 1. 0 mL· min －1 ； 柱温 40 ℃ ； 检测波长： 214 nm。结果： 硫酸鱼精蛋白线性范围为 0. 05 ～ 2. 5 mg·mL －1 （ r = 0. 9994） ，方法平均回收率（ n = 9） 为 99. 7% 。
精蛋白锌胰岛素注射液为含有鱼精蛋白与氯化 锌的胰岛素（ 猪或牛） 的灭菌混悬液，每 100 单位中 含鱼精蛋白 1. 0 ～ 1. 5 mg 与锌 0. 2 ～ 0. 25 mg［1］，是 1 种具有延缓释放作用［2］的动物胰岛素制剂。在含 有少量锌离子和苯酚的中性条件下，带负电荷的胰 岛素与带正电荷的硫酸鱼精蛋白结合形成棒状晶型 的白色沉淀，使其在人体液中溶解度降低从而达到 延时释放 的 目 的［3］。 鱼 精 蛋 白 从 多 种 鱼 类 精 子 中 提制而成，是 1 种强碱性低分子蛋白质，含有大量的 精氨酸（ 约 70% ） ，易溶于水，通常为硫酸盐形式［4］。 精蛋白锌胰岛素注射液的药动学参数（ 起效时间，
图 1 对照品（ A） 、供试品（ B） 和空白（ C） 色谱图 Fig 1 LC chromatograms of chemical reference substances（ A） ，sample （ B） and blank（ C） 1，2． 硫酸鱼精蛋白（ protamine sulfate） 3． 苯酚（ phenol） 4． 胰岛素 （ insulin）
结论： 本方法准确、简便、快速，重复性好，可用于精蛋白锌胰岛素注射液中硫酸鱼精蛋白的含量测定。
关键词： 高效液相色谱； 精蛋白； 氯化锌； 胰岛素； 缓释制剂； 质量检测
中图分类号： R917
文献标识码： A
文章编号： 0254 － 1793（ 2012） 04 － 0679 － 03
Study on determination of protamine sulfate in protamine zine insulin injection*
色谱柱： Grace Vydac C18 色谱柱（ 250 mm × 4. 6 mm，5 μm） ； 流动相： 以 A： 乙腈 － 0. 2 mol·L － 1 硫酸 钠溶液（ 4∶ 96） ； B： 乙腈 － 水（ 50 ∶ 50） 为流动相进行 梯度洗脱（ 0 ～ 8 min 时 B 0% →70% ，8 ～ 15 min 时 B 70% ，15 ～ 16 min 时 B 70% →0% ，16 ～ 30 min 时 0% ） ； 流速： 1. 0 mL· min － 1 ； 柱温 40 ℃ ； 紫外检测 器，检测波长： 214 nm。进样： 20 μL。将保留时间 4 ～ 8 min 两峰面积的和作为硫酸鱼精蛋白的总峰面 积，与对照品峰面积的和比较，计算硫酸鱼精蛋白的 含量。本文色谱条件下色谱图见图 1。
3 溶液制备 3. 1 对照品溶液 称取硫酸鱼精蛋白对照品适量， 精密称定，加 0. 01 mol·L － 1 盐酸制成每 wk.baidu.com mL 约含 硫酸鱼精蛋白 0. 5 mg 的溶液作为对照品溶液。
3. 2 供试品溶液 取精蛋白锌胰岛素注射液，按每 1 mL 加 9. 6 mol·L － 1 盐酸 3 μL 酸化，混匀，作为供 试品溶液。 4 空白干扰试验
DING Xiao － li1 ，SONG Min2 ，ZHANG Hui1 ，LIANG Cheng － gang1＊＊
（ 1． National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China； 2． Wuhan Institute for Drug Control，Wuhan 430012，China）
药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012，32（ 4）
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水平 （ fortified level） / %
80
100
120
样品 （ sample No． ）
1 2 3 1 2 3 1 2 3
表 1 回收率结果 Tab 1 Results of the recoveries
＊ 国家科技重大专项“重大新药创制 － － 创新药物研究开发技术平台建设”（ 2009ZX09307） ＊＊ 通讯作者 Tel： （ 010） 67095349； E － mail： liangchenggang@ nicpbp． org． cn
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药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012，32（ 4）
1 仪器与试药 日本岛津 LC － 20AD 型高效液相色谱仪。 硫酸鱼精蛋白对照品（ 某生产企业提供的生产
用原料，编号： 005041，纯度： 94. 3% ） 。精蛋白锌胰 岛素 注 射 液 （ 批 号： 0906241，0912215，1001227， 1003205，1003213，1003217） 由 A 企业生产，（ 批号： 081203） 由 B 企业生产，每 100 单位含硫酸鱼精蛋 白为 1. 0 ～ 1. 5 mg。乙腈为 Fisher 公司生产的色谱 纯试剂，试验用水为 Millipore 超纯水机制去离子水。 2 色谱条件
加入量 （ added） / mg
6. 44 6. 89 6. 64 8. 82 8. 73 8. 08 9. 93 9. 67 9. 89
测得值 （ found） / mg
取 0. 01 mol·L － 1 盐酸作为空白溶液，按拟定的 色谱条件进样。空白溶液的色谱图中，在硫酸鱼精 蛋白峰相应的保留时间处无任何色谱峰出现，空白 对硫酸鱼精蛋白测定没有影响。见图 1。 5 方法学验证 5. 1 系统适用性试验 分别取对照品溶液、供试品 溶液，按上述色谱条件进样分析。硫酸鱼精蛋白和 处方中苯酚、胰岛 素 峰 的 分 离 度 大 于 1. 5，符 合 要 求，以信噪比 S / N = 3 计算，本法对硫酸鱼精蛋白的 检测限为 51. 09 ng。 5. 2 线性关系考察 称取硫酸鱼精蛋白对照品适 量，用 0. 01 mol·L － 1 盐酸溶解并稀释成含硫酸鱼精 蛋白约为 0. 05，0. 1，0. 25，0. 5，1. 0，2. 5 mg ·mL － 1 的系列对照品溶液，分别进样 20 μL，以硫酸鱼精蛋 白的浓度（ X，mg·mL － 1 ） 为横坐标，峰面积（ Y） 为纵 坐标作图，进行线性回归，得到硫酸鱼精蛋白的线性 方程为： Y = 2. 496 × 105 + 8. 023 × 106 X r = 0. 9994 结果表明： 硫酸鱼精蛋白在 0. 05 ～ 2. 5 mg·mL － 1 范 围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。 5. 3 精密度试验 按“3. 1”项下方法制备对照品 溶液，连续进样 6 次，每次 20 μL，测定硫酸鱼精蛋 白的峰面积，计算 RSD 为 0. 5% 。 5. 4 重复性试验 按“3. 2”项下方法制备测定浓 度 80% 及 100% 供 试 品 溶 液 各 3 份，分 别 进 样 20 μL，根据线性方程计算供试品溶液中硫酸鱼精蛋白 的含量，6 份供试品测定结果的 RSD 为 0. 7% 。 5. 5 回收率试验 取精蛋白锌胰岛素注射液按每 1 mL 加 9. 6 mol·L －1 盐酸 3 μL 酸化，混匀，精密量取 9 份，每份各 10 mL（ 约相当于硫酸鱼精蛋白 5 mg） ，3 份为一组，每组分别精密加入硫酸鱼精蛋白对照品 5，7. 5，10 mg，置 25 mL 量瓶中，加 0. 01 mol·L －1 盐酸 溶解并稀释至刻度，另取“3. 1”项下制备的对照品溶 液，按拟定的色谱条件进行测定，以峰面积和计算。 结果见表 1。平均回收率（ n = 9） 为 99. 7% 。 5. 6 稳定性试验 按“3. 1”项下方法制备对照品溶 液，分别在 0，2，5，10，14，18，24 h 进样，每次 20 μL，测 定硫酸鱼精蛋白的峰面积，计算 RSD 为 0. 8% 。
Abstract Objective： To approach an assay method of determination for protamine sulfate in protamine zine insulin injection by HPLC method． Methods： The assay was performed on Grace Vydac C18 column（ 250 mm × 4. 6 mm，5 μm） with a gradient program （ 0 － 8 min B 0% →70% ，8 － 15 min B 70% ，15 － 16 min B 70% →0% ，16 － 30 min B 0% ） of A： acetonitrile － 0. 2 mol·L － 1 sodium sulfate（ 4 ∶ 96） and B： acetonitrile － water（ 50 ∶ 50） as the mobile phase； The column temperature was set up at 40 ℃ and the flow rate was 1. 0 mL· min － 1 ． The absorbance was monitored at 214 nm． Results： The line ranges of protamine sulfate was 0. 05 － 2. 5 mg·mL － 1 （ r = 0. 9994） ． The average recoveries （ n = 9） of protamine sulfate was 99. 7% ． Conclusions： The method is proved to be rapid，accurate and convenient，and provided a reliable way for protamine sulfate the quality of． protamine zine insulin injection． Key words： HPLC； protamine； zinc chloride； insulin； Sustained － release preparation； quality examination
峰浓度，持续作用时间等） 与鱼精蛋白的含量和质 量都存在很大的关系［5］，有效控制鱼精蛋白的含量 很有必要。中国药典 2010 年版以及现行美国药典 32 版［6］和欧洲药典 7. 0 版［7］，均未对精蛋白锌胰岛 素注射液中的硫酸鱼精蛋白含量进行控制。本文采 用反相高效液相色谱法通过梯度洗脱将鱼精蛋白多 个多肽峰合并为 2 个较大的色谱峰，将两峰面积的 和作为硫酸鱼精蛋白的总峰面积测定精蛋白锌胰岛 素注射液中硫酸鱼精蛋白的含量，方法准确、简便、 快速，重复性好，通过进一步完善，可用于精蛋白锌 胰岛素注射液中硫酸鱼精蛋白的含量测定。
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精蛋白锌胰岛素注射液中硫酸鱼精蛋白含量测定的方法研究*
丁晓丽1 ，宋敏2 ，张慧1 ，梁成罡1＊＊
（ 1． 中国食品药品检定研究院，北京 100050； 2． 武汉市药品检验所，武汉 430012）
摘要 目的： 建立高效液相色谱（ HPLC） 法测定精蛋白锌胰岛素注射液中硫酸鱼精蛋白的含量。方法： 采用 Grace Vydac C18 色 谱柱（ 250 mm × 4. 6 mm，5 μm） ，以 A： 乙腈 － 0. 2 mol·L －1 硫酸钠溶液（ 4∶ 96） ； B： 乙腈 － 水（ 50∶ 50） 为流动相进行梯度洗脱（ 0 ～ 8 min 时 B0% →70% ，8 ～ 15 min 时 B70% ，15 ～ 16 min 时 B70% →0% ，16 ～ 30 min 时 B0% ） ； 流速 1. 0 mL· min －1 ； 柱温 40 ℃ ； 检测波长： 214 nm。结果： 硫酸鱼精蛋白线性范围为 0. 05 ～ 2. 5 mg·mL －1 （ r = 0. 9994） ，方法平均回收率（ n = 9） 为 99. 7% 。
精蛋白锌胰岛素注射液为含有鱼精蛋白与氯化 锌的胰岛素（ 猪或牛） 的灭菌混悬液，每 100 单位中 含鱼精蛋白 1. 0 ～ 1. 5 mg 与锌 0. 2 ～ 0. 25 mg［1］，是 1 种具有延缓释放作用［2］的动物胰岛素制剂。在含 有少量锌离子和苯酚的中性条件下，带负电荷的胰 岛素与带正电荷的硫酸鱼精蛋白结合形成棒状晶型 的白色沉淀，使其在人体液中溶解度降低从而达到 延时释放 的 目 的［3］。 鱼 精 蛋 白 从 多 种 鱼 类 精 子 中 提制而成，是 1 种强碱性低分子蛋白质，含有大量的 精氨酸（ 约 70% ） ，易溶于水，通常为硫酸盐形式［4］。 精蛋白锌胰岛素注射液的药动学参数（ 起效时间，
图 1 对照品（ A） 、供试品（ B） 和空白（ C） 色谱图 Fig 1 LC chromatograms of chemical reference substances（ A） ，sample （ B） and blank（ C） 1，2． 硫酸鱼精蛋白（ protamine sulfate） 3． 苯酚（ phenol） 4． 胰岛素 （ insulin）
结论： 本方法准确、简便、快速，重复性好，可用于精蛋白锌胰岛素注射液中硫酸鱼精蛋白的含量测定。
关键词： 高效液相色谱； 精蛋白； 氯化锌； 胰岛素； 缓释制剂； 质量检测
中图分类号： R917
文献标识码： A
文章编号： 0254 － 1793（ 2012） 04 － 0679 － 03
Study on determination of protamine sulfate in protamine zine insulin injection*
色谱柱： Grace Vydac C18 色谱柱（ 250 mm × 4. 6 mm，5 μm） ； 流动相： 以 A： 乙腈 － 0. 2 mol·L － 1 硫酸 钠溶液（ 4∶ 96） ； B： 乙腈 － 水（ 50 ∶ 50） 为流动相进行 梯度洗脱（ 0 ～ 8 min 时 B 0% →70% ，8 ～ 15 min 时 B 70% ，15 ～ 16 min 时 B 70% →0% ，16 ～ 30 min 时 0% ） ； 流速： 1. 0 mL· min － 1 ； 柱温 40 ℃ ； 紫外检测 器，检测波长： 214 nm。进样： 20 μL。将保留时间 4 ～ 8 min 两峰面积的和作为硫酸鱼精蛋白的总峰面 积，与对照品峰面积的和比较，计算硫酸鱼精蛋白的 含量。本文色谱条件下色谱图见图 1。
3 溶液制备 3. 1 对照品溶液 称取硫酸鱼精蛋白对照品适量， 精密称定，加 0. 01 mol·L － 1 盐酸制成每 wk.baidu.com mL 约含 硫酸鱼精蛋白 0. 5 mg 的溶液作为对照品溶液。
3. 2 供试品溶液 取精蛋白锌胰岛素注射液，按每 1 mL 加 9. 6 mol·L － 1 盐酸 3 μL 酸化，混匀，作为供 试品溶液。 4 空白干扰试验
DING Xiao － li1 ，SONG Min2 ，ZHANG Hui1 ，LIANG Cheng － gang1＊＊
（ 1． National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China； 2． Wuhan Institute for Drug Control，Wuhan 430012，China）
药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012，32（ 4）
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水平 （ fortified level） / %
80
100
120
样品 （ sample No． ）
1 2 3 1 2 3 1 2 3
表 1 回收率结果 Tab 1 Results of the recoveries
＊ 国家科技重大专项“重大新药创制 － － 创新药物研究开发技术平台建设”（ 2009ZX09307） ＊＊ 通讯作者 Tel： （ 010） 67095349； E － mail： liangchenggang@ nicpbp． org． cn
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药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012，32（ 4）
1 仪器与试药 日本岛津 LC － 20AD 型高效液相色谱仪。 硫酸鱼精蛋白对照品（ 某生产企业提供的生产
用原料，编号： 005041，纯度： 94. 3% ） 。精蛋白锌胰 岛素 注 射 液 （ 批 号： 0906241，0912215，1001227， 1003205，1003213，1003217） 由 A 企业生产，（ 批号： 081203） 由 B 企业生产，每 100 单位含硫酸鱼精蛋 白为 1. 0 ～ 1. 5 mg。乙腈为 Fisher 公司生产的色谱 纯试剂，试验用水为 Millipore 超纯水机制去离子水。 2 色谱条件
加入量 （ added） / mg
6. 44 6. 89 6. 64 8. 82 8. 73 8. 08 9. 93 9. 67 9. 89
测得值 （ found） / mg
取 0. 01 mol·L － 1 盐酸作为空白溶液，按拟定的 色谱条件进样。空白溶液的色谱图中，在硫酸鱼精 蛋白峰相应的保留时间处无任何色谱峰出现，空白 对硫酸鱼精蛋白测定没有影响。见图 1。 5 方法学验证 5. 1 系统适用性试验 分别取对照品溶液、供试品 溶液，按上述色谱条件进样分析。硫酸鱼精蛋白和 处方中苯酚、胰岛 素 峰 的 分 离 度 大 于 1. 5，符 合 要 求，以信噪比 S / N = 3 计算，本法对硫酸鱼精蛋白的 检测限为 51. 09 ng。 5. 2 线性关系考察 称取硫酸鱼精蛋白对照品适 量，用 0. 01 mol·L － 1 盐酸溶解并稀释成含硫酸鱼精 蛋白约为 0. 05，0. 1，0. 25，0. 5，1. 0，2. 5 mg ·mL － 1 的系列对照品溶液，分别进样 20 μL，以硫酸鱼精蛋 白的浓度（ X，mg·mL － 1 ） 为横坐标，峰面积（ Y） 为纵 坐标作图，进行线性回归，得到硫酸鱼精蛋白的线性 方程为： Y = 2. 496 × 105 + 8. 023 × 106 X r = 0. 9994 结果表明： 硫酸鱼精蛋白在 0. 05 ～ 2. 5 mg·mL － 1 范 围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。 5. 3 精密度试验 按“3. 1”项下方法制备对照品 溶液，连续进样 6 次，每次 20 μL，测定硫酸鱼精蛋 白的峰面积，计算 RSD 为 0. 5% 。 5. 4 重复性试验 按“3. 2”项下方法制备测定浓 度 80% 及 100% 供 试 品 溶 液 各 3 份，分 别 进 样 20 μL，根据线性方程计算供试品溶液中硫酸鱼精蛋白 的含量，6 份供试品测定结果的 RSD 为 0. 7% 。 5. 5 回收率试验 取精蛋白锌胰岛素注射液按每 1 mL 加 9. 6 mol·L －1 盐酸 3 μL 酸化，混匀，精密量取 9 份，每份各 10 mL（ 约相当于硫酸鱼精蛋白 5 mg） ，3 份为一组，每组分别精密加入硫酸鱼精蛋白对照品 5，7. 5，10 mg，置 25 mL 量瓶中，加 0. 01 mol·L －1 盐酸 溶解并稀释至刻度，另取“3. 1”项下制备的对照品溶 液，按拟定的色谱条件进行测定，以峰面积和计算。 结果见表 1。平均回收率（ n = 9） 为 99. 7% 。 5. 6 稳定性试验 按“3. 1”项下方法制备对照品溶 液，分别在 0，2，5，10，14，18，24 h 进样，每次 20 μL，测 定硫酸鱼精蛋白的峰面积，计算 RSD 为 0. 8% 。
Abstract Objective： To approach an assay method of determination for protamine sulfate in protamine zine insulin injection by HPLC method． Methods： The assay was performed on Grace Vydac C18 column（ 250 mm × 4. 6 mm，5 μm） with a gradient program （ 0 － 8 min B 0% →70% ，8 － 15 min B 70% ，15 － 16 min B 70% →0% ，16 － 30 min B 0% ） of A： acetonitrile － 0. 2 mol·L － 1 sodium sulfate（ 4 ∶ 96） and B： acetonitrile － water（ 50 ∶ 50） as the mobile phase； The column temperature was set up at 40 ℃ and the flow rate was 1. 0 mL· min － 1 ． The absorbance was monitored at 214 nm． Results： The line ranges of protamine sulfate was 0. 05 － 2. 5 mg·mL － 1 （ r = 0. 9994） ． The average recoveries （ n = 9） of protamine sulfate was 99. 7% ． Conclusions： The method is proved to be rapid，accurate and convenient，and provided a reliable way for protamine sulfate the quality of． protamine zine insulin injection． Key words： HPLC； protamine； zinc chloride； insulin； Sustained － release preparation； quality examination
峰浓度，持续作用时间等） 与鱼精蛋白的含量和质 量都存在很大的关系［5］，有效控制鱼精蛋白的含量 很有必要。中国药典 2010 年版以及现行美国药典 32 版［6］和欧洲药典 7. 0 版［7］，均未对精蛋白锌胰岛 素注射液中的硫酸鱼精蛋白含量进行控制。本文采 用反相高效液相色谱法通过梯度洗脱将鱼精蛋白多 个多肽峰合并为 2 个较大的色谱峰，将两峰面积的 和作为硫酸鱼精蛋白的总峰面积测定精蛋白锌胰岛 素注射液中硫酸鱼精蛋白的含量，方法准确、简便、 快速，重复性好，通过进一步完善，可用于精蛋白锌 胰岛素注射液中硫酸鱼精蛋白的含量测定。