海藻糖对酶热稳定性保护作用的研究

海藻糖对酶热稳定性保护作用的研究

李　群　袁勤生　李永丰

(华东理工大学生化研究所,上海200237)

摘　要　初步研究了海藻糖在保护酶蛋白热稳定性方面的作用。实验表明:海藻糖可以作为一种天然保藏剂,有效地提高酶蛋白的热稳定性;本文还分别比较了葡萄糖、蔗糖、甘露醇和海藻糖对酶蛋白的保护效果,结果发现海藻糖保护效果最佳,蔗糖次之,葡萄糖和甘露醇较差。

关键词　海藻糖;乙醇脱氢酶;超氧化物岐化酶(SOD);热稳定性

酶在医药、化工、食品及临床与化学分析等领域获得了广泛的应用。但是由于酶不稳定而使其应用开发受到限制。虽然引起酶蛋白变性的因素很多,如物理因素、化学因素以及生物学因素等,但是温度却是造成酶失活的最主要因素。近年来,一种建立在海藻糖基础上的天然保藏剂,为酶的热稳定性保护提供了新的方法。海藻糖是由两个葡萄糖残基通过半缩醛羟基结合而成的一个非还原性二糖,在昆虫、无脊椎动物、酵母、真菌的孢子和子实体以及高等植物中都发现其存在,化学性质很稳定[1]。本文采用海藻糖作为酶的稳定介质,初步研究了它对乙醇脱氢酶和SOD 的保护作用,并比较了葡萄糖、蔗糖、甘露醇和海藻糖在保护酶活方面的效果。

1　材料与方法

1.1　材料

海藻糖由上海生化试剂商店提供;SOD 由华东理工大学生化研究所提供;葡萄糖、蔗糖、甘露醇均为分析纯试剂。

1.2　方法

1.2.1　酵母中乙醇脱氢酶的制备[2]

150ml0.066mol/L的Na2HPO4溶液加入到达50克酿酒酵母细胞中,37℃水浴中搅拌保温2h后,取出,室温下再搅拌抽提3h,离心弃菌体,上清液立即置于55℃水浴中15m in,冷却后离心,上清液置0℃冰箱中过夜。

冰浴下按每100ml的抽提液中,加入50m l的冷丙酮,20min后,0℃离心,弃沉淀;再在上清液中按每100ml加入55ml冷丙酮, 0℃维持20m in后离心,弃上清液,沉淀用冰水溶解,置透析袋中透析3h,3500r/min下离心20m in,弃沉淀。每100ml上清液中加入36g硫酸铵,0℃冰箱放置3h,14000r/m in离心20min,弃上清液;沉淀用15ml水溶解,加入3g硫酸铵,盐析3h后离心弃沉淀。上清液中即含有乙醇脱氢酶。

乙醇脱氢酶活力测定采用Dotzayer 法[3]。

1.2.2　酵母蛋白的制备及测定(4)　20克酵母中加水30ml,在-20℃下速冻2h,取出放在20℃恒温水浴中保温30min,为一次冻融;重复三次。离心取出上清液,得到酵母蛋白。

利用紫外分光光度计分别测定酵母蛋白溶液样品在260nm,280nm处的吸光度值,按下表计算蛋白含量:

蛋白质浓度(mg/m l)= 1.55A280-0.77A260

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药　物　生　物　技　术

Pharm aceutical Biotechnology　1997,4(1):28～31

收稿日期　1996-05-20

1.2.3　海藻糖对酶热稳定性的影响　分别在25mmol/L、100mmol/L海藻糖溶液中,加入等体积的乙醇脱氢酶溶液,在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的水浴中加热8m in,冰水冷却后,以相应不加热的酶活力作对照(100%),测定乙醇脱氢酶活力保留率。

在加入蛋白质溶液的乙醇脱氢酶溶液中,分别等体积地加入0.5mol/L的海藻糖溶液,不同温度下,水浴8min,冰水冷却后,以相应不加热的酶活力作对照(100%),测定酶活力保留率。

在50m mol/L、100mm ol/L海藻糖的水溶液中分别加入等体积的SOD(1560U),在不同的温度下加热20m in后,冰水冷却,测SOD活力,以不加热的SOD活力作对照(100%),计算SOD活力保留率,SOD活性测定采用改进的邻苯三酚自氧化法[5]。

1.2.4　其它多羟基化合物对酶热稳定性的影响　0.5mol/L葡萄糖、蔗糖、甘露醇分别等体积地加入到乙醇脱氢酶中,不同温度下处理8min,以相应不加热酶活力作对照(100%),测定酶活力保留率。

1.2.5　海藻糖对SOD反复冻融时的活力影响　在50m mol/L、100mm ol/L、500mm ol/L 海藻糖溶液中,分别等体积加入SOD (1835U),0℃冰箱中冷冻,25℃水浴中融化,为一次冻融;重复两次,测SOD活力;以不冻融SOD活力作为对照(100%),测定三次反复冻融后的SOD活力保留率。

2　结果

2.1　海藻糖对乙醇脱氢酶活力的保护作用

酶活力保留率的高低与海藻糖的浓度密切相关。从图中可见,500mm ol/L海藻糖的效果最好,25m mol/L海藻糖较差,但是它们都比不加海藻糖的酶溶液活力要高,说明海藻糖可以稳定乙醇脱氢酶。见图1。

2.2　蛋白质对乙醇脱氢酶稳定性的影响

酵母体内的代谢是一个很复杂的过程,体内蛋白质之间的相互作用非常复杂,为了了解体内海藻糖的作用,利用酵母抽提液,检测乙醇脱氢酶活力保留率。酵母蛋白质的浓度为9mg/ml。结果见表1。

F ig1.　T hermal stability of alcohol dehy dr ogenase as influenced by trehalose.

—◆—500mmol/L　—■—100mmol/L　—△—50mmol/L —×—25mmol/L　—*—Control

T ab1.Pr otecive effects of alcohol dehy dr ogenase by the additio n o f yeast protein and t rehalose

T emper atur e

(℃)

0.5mmo l/L

tr ehalose+pr otein

P rotein

3098.298.4

4090.686.2

44.585.577.3

5071.462.4

5552.735.7

57.523.911.2

6011.5 3.5

6200

2.3　海藻糖对SOD热稳定性影响

SOD在不同浓度海藻中以不同温度处理20m in,其残余酶活力如表2。从结果中可看出,相对于空白SOD而言,海藻糖具有保护SOD酶活力的作用,但是由于SOD本身是一个含金属的酶,与其它一些酶相比,对温度不太敏感,因此海藻糖对SOD的热稳定性保护效果不那么明显。

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