多药耐药

【前沿】基因缺陷动物模型促进药物跨膜转运研究

药物膜转运蛋白是存在于细胞膜上的在药物吸收、分布、排泄中起重要作用

的一类蛋白，利用膜转运蛋白的性质来增加药物吸收、改变药物分布或排泄性质，

可达到增加药物疗效或减少药物不良反应的目的。基因缺陷动物模型是研究

膜转运蛋白功能的重要手段之一，分为先天遗传性基因缺陷模型和基因敲除模型。

其中，基因敲除技术是19世纪80年代后半期应用DNA同源重组原理和胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养发展起来的一门新技术，是指对一个结构已知但功能

未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其他顺序相近的基因

取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。近年来，利用基因缺陷

动物模型研究膜转运蛋白取得了快速的进展。

■mdr1a基因敲除小鼠模型

P糖蛋白(P-gp)是ATP能量依赖性的药物外排转运体，有关P-gp在多药耐

药性方面的作用研究已进行了多年，其中大多数实验成果归功于对P-gp基因敲除

小鼠模型mdr1a(-/-)的利用。目前已发现的人类P-gp基因有两个成员，即MDR1和MDR2；在啮齿类有3个成员，即mdr1a、mdr1b和mdr2。研究表明，MDR1、mdr1a和mdr1b基因参与多药耐药。P-gp一旦与药物结合，则通过ATP提供的能量，将药物

从胞内泵出，使药物在胞浆内的浓度逐渐降低，从而导致药物作用减弱或消失，

是许多抗癌药物出现耐药现象的主要原因之一。

为了深入研究P-gp的功能和对药物转运的影响，荷兰肿瘤研究所的Schinkel

等用转基因技术建立了mdr1a(类似人的MDR1)基因缺失小鼠，称mdr1a(-/-)小鼠。mdr1a(-/-)小鼠没有明显的生理缺陷，并可繁殖。mdr1a(-/-)小鼠在肠道不表达

P-gp功能，此种小鼠不用P-gp抑制剂时，若药物有转运，就可肯定此药物为非P-

gp转运。此模型可以真实反映药物跨膜的被动吸收，在与野生型动物实验对比时

又能快速定位P-gp蛋白。

该模型已用于研究P-gp的作用及其在小鼠全肠中的表达部位，并尝试性地用

于寻找P-gp是否对外源性物质的肠上皮被动转运有决定性作用。在mdr1a(+/+)小

鼠中，紫杉醇从黏膜层向基底层转运时，转运很少且各肠段差异不大。而在mdr1

a(-/-)小鼠中，其吸收有很大提高，差异变大，结肠末端的吸收比在野生型鼠中

高出5倍，远端空肠和近端回肠高出两倍。比较紫杉醇在两种鼠中的外排情况，

野生型鼠显示出其在各肠段分泌的显著变化，分泌最多的是回肠和结肠远端，最

少的是空肠和结肠近端。相反，从基底层向黏膜层转运时，在mdr1a(-/-)小鼠中

紫杉醇的分泌被完全抑制。由此表明，P-gp在肠中是紫杉醇惟一的外排调节蛋白，

敲除P-gp基因可以显著显示此药物的被动转运有部位依赖性。

■Mdr2基因敲除小鼠模型

实验证明，抑制胆管糖蛋白转运体可以引起家族性胆汁郁积症。MDR3基因突

变可以诱导3-型家族胆汁郁积症。小鼠中mdr2基因突变就类似于人类的MDR3缺陷症。破坏mdr2基因和用CsA（环孢素A）抑制糖蛋白转运体都可以导致小鼠胆汁郁

积症，其表现为胆汁流量减小，胆汁和胆脂质分泌减少。但CsA不会明显增加mdr

2基因敲除小鼠的胆汁郁积症状。牛黄胆酸可以减少mdr2基因敲除小鼠和用CsA抑

制糖蛋白转运体的小鼠的胆汁郁积症状。

■Mrp1基因敲除小鼠模型

Mrp1蛋白与P-gp同为ATP结合的盒式膜转运蛋白家族成员。Mrp1主要的生物学

功能包括1)保护机体免受环境中存在的氧化态重金属阴离子的伤害。Braman等

研究表明，小鼠Mrp1(-/-)细胞株较正常小鼠Mrp1(+/+)对氧化态重金属阴离子的

敏感性增加。由挪威放射医院Rappa等做的类似实验结果出现在Mrp转染的细胞系中，但未在体内实验中重现此结果，原因可能是重金属毒性作用的重要靶器官—

—肝脏在正常生理条件下低表达Mrp，干扰Mrp表达并不影响肝脏对重金属的解毒

功能。(2)调节离子通道活性。加拿大女皇大学的Jirsch等报道，表达Mrp1的细

胞株伴钾离子通道和浓度调节的氯离子通道电流增加，改变Mrp1的表达水平时也

发现有内向的钾离子通道开放，但在Mrp1基因敲除小鼠的胚胎干细胞中，并没有

出现支持这一结论的实验结果，提示离子通道的调节可能存在着种属差异。

■Mrp2先天性基因缺陷大鼠模型

Mrp2是一种多药耐药相关蛋白，它不仅在药物胆排泄中起着重要的作用，也

和多种药物的耐药有关。Mrp2基因缺陷动物模型目前常用的有两种，即hyperbi- lirubinemic Groningen Yellow/TR-（GY/TR-）及Eisai hyperbilirubinemic (EHBR)两种大鼠。它们分别从Wistar和SD大鼠变异而来。有机阴离子的胆汁分泌被Mrp2调节，通过比较正常鼠和Mrp2缺陷鼠药物的跨胆小管膜分泌可以来确定Mrp2的底物，这些模型还可以很好地研究人类Dubin－Johnson综合征的发病机理。通过模型动物的实验结果显示，Mrp2底物包括谷胱甘肽、葡萄糖醛酸结合物和游

离有机阴离子。

EHBR大鼠模型此模型为先天缺失胆管Mrp2的一种SD大鼠。为了研究胆酸结合药物的胆管分泌，研究人员用血栓素A2（TXA2）受体拮抗剂Z-335及其胆酸结合

物Z-335－Tau进行跨胆管膜转运实验，发现Z-335在胆管通过Mrp2排泄，但是Z-3 35－Tau进入胆汁不是通过Mrp2，而是其他ATP依赖性的转运体。通过利用Mrp2基因缺失动物实验，还可发现大环内酯类抗生素阿奇霉素以及药物的硫酸结合物也

是Mrp2的底物。

GY/TR-大鼠模型GY/TR-大鼠通过Wistar大鼠的基因突变得来，在肝实质细胞

膜上不表达Mrp2，可以在功能水平上对肝部转运机理提供很好的研究。该模型常

用来鉴定Mrp2的底物，主要研究范围是谷胱甘肽结合物、葡萄糖醛酸结合物、硫

酸结合物及其他两性离子的胆汁分泌。

Mrp2在肾近曲小管细胞膜上有表达，但过去很少有其参与药物肾脏排泄的报道。荷兰内梅亨大学医学院的Rosalinde研究了Mrp2在肾脏中的作用，他用Mrp2的底物calcein与fluo-3分别对Wistar Hannover和TR-大鼠模型进行离体肾脏灌流,

结果发现，calcein和fluo-3在TR-的肾脏分泌率低于Wistar Hannover大鼠。Mrp

2底物calcein和fluo-3的肾脏清除率在TR-大鼠显著减少，从而使人们认识了Mrp 2在肾排泄中的作用。

基因缺陷动物模型在药物跨膜转运研究中发挥了很大的作用，但目前也存在

模型较少、供货渠道单一和价格较高的问题，从而限制了其使用。相信随着人们

对膜转运蛋白作用研究的重视，会出现更多类型的药物转运蛋白基因缺失动物模

型，加快人们在药物转运领域的研究步伐。