染色体倍性分析详细步骤

染色体倍性分析实验步骤
广州吉源生物科技有限公司在长期的倍性实验中，摸索了一套植物样本以及水产样本的倍性分析实验操作指南供广大倍性分析研究者参考。

第一部分植物样本的倍性分析
一、样品的采集与保存：
叶片的新鲜程度直接影响实验结果。

由于次生代谢产物的影响，会导致信号峰过宽，甚至检测不到信号峰的情况。

嫩叶的选择要选取新鲜、完全舒展开、无虫咬、无枯萎、分裂不活跃的部位。

新鲜叶片，滤纸打湿之后包裹样本保湿，放入自封袋中做好标记，再放入泡沫箱密封。

若短期内不能检测，可将叶片使用硅胶干法进行保存。

每一个测试需要的叶片面积是0.5cm2，大约小拇指甲盖大小。

准备测试的叶片应为此量的4倍以上，已备重复实验用。

准备标样，搞清楚标样的倍性。

一定要有同物种亲缘较近的已知倍性样本作为参照，否则样本无法确定倍性。

二、实验过程：
1. 取新鲜标样植物叶片0.5cm2，置于培养皿中。

2. 取Partec CyStain UV Precise P（货号：05-5002）核裂解液400μl 加于植物叶片周围，用锋利刀片将叶片切碎（切不可在培养皿底部刮蹭），以充分提取出完整的细胞核，提取时间取决于样本性质，一般为10秒。

3. 将培养皿中的液体用30μm 滤网（货号：04-0042-2316）过滤至样品管中
4. 向样品管中加入Partec CyStain UV Precise P 染色液1600μl，染色时间取决于样本性质，一般为10秒。

5. 上机测试：调整Gain值（Gain值在200V-600V范围内），以及Thresholds阈值使标样的荧光强度在100（横坐标）或50，根据标样的倍性具体来定，如果标样是2倍体待测样本是4倍体或者6倍体，尽量让标样的位置在100或者50的位置，如果标样是4倍体或六倍体，待测样品是2倍体，标样的位置尽量调到150-300的位置。

检测速度为0.5-2μl/s,主峰的细胞数量需要达到1000-3000个，以保证数据具有统计学意义。

6．取待测样品，重复1-4。

上机测试后看样品荧光强度的位置，与标样比较。

根据荧光强度就可以确定待测样品的倍性。

样本之间的误差范围在±5%内。

7.实验使用的仪器是Sysmex Partec品牌的CyFlow PA，试剂盒是Sysmex Partec的CyStain UV Precise P试剂盒（货号：05-5002）。

第二部分水产样本的倍性分析
一、鱼类的样品采集与保存
1. 大鱼可以取血液样本检测。

鱼血的抽取是用注射器抽取，有主要有三种方法：（1）在鱼臀鳍的侧线偏下进针，碰到脊椎后稍微偏一点插入尾静脉抽血。

（2）心脏取穴，注射器直接插入心腔内取血，最好是活的鱼，取新鲜鱼血。

（3）剪断鱼尾取血，这种方法除了用注射器外，用毛细管也可以。

2 取鱼组织检测，切取0.5cm2大小的新鲜鱼肉即可。

3 小鱼苗可以直接用整条鱼检测
二、贝类样本的采集与保存
贝类大样本可以直接撬开贝壳，取贝的新鲜组织作为样本。

贝类幼苗需要收集刚孵化2-3天内的浮游状态的幼苗。

三、实验过程：
组织样本的实验与植物的实验过程相同，加裂解液用刀片切碎，然后过滤染色，上机即可。

鱼血或者贝类的幼苗可以直接染色上机。

需要注意的是，常规流式也就是只搭配488nm蓝色激光的流式无法使用该方案。

另外也要注意仪器的设门和阈值。

三、实验原理：
首先和裂解液将细胞核释放出来，并打开DNA链，然后用DAPI染液将细胞核染色体上的AT碱基特异性染色，再用仪器检测出细胞核里被染色的AT碱基发出的荧光强度。

比如二倍体的荧光强度是100（横坐标），那么单倍体的荧光强度就是50（横坐标）。

结果的纵坐标是细胞数量的显示，通常来说，信号峰高说明信号比较好，杂质少。

倍性=待测样本的峰值/ 参照物的峰值*参照物倍性
e.g. 100/50 x 2n = 4n。