桑叶成分测定方法

桑叶成分测定方法
茶多酚的测定（GB/T 8313-2002）
本标准适用于茶叶中茶多酚的测定，不适用于茶叶提取物制品中茶多酚的测定。

引用标准：GB/T 8302-2002 茶取样；GB/T 8312-2002 茶咖啡碱测定；
GB/T 8303-2002 茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定；
茶多酚（tea polyphenols）：茶叶水浸出物中与亚铁离子产生络合反应的酚类物质。

原理：茶叶中多酚类物质能与与亚铁离子形成紫蓝色络合物。

用分光光度法测定其含量。

设备：分析天平、分光光度计。

试剂和溶液：水为蒸馏水。

1、酒石酸亚铁溶液：称取1g (准确至0.0001g) 硫酸亚铁和5g (准确至0.0001g)酒石酸钾钠，用水溶解并定容至1L(溶液应避光，低温保存，有效期一个月)。

2、pH7.5磷酸盐缓冲液：
1/15mol/L磷酸氢二钠: 称取23.9g十二水磷酸氢二钾钠，加水溶解后定容至1L。

1/15mol/L 磷酸二氢钾：称取经110度烘干2h的磷酸二氢钾9.08g，加水溶解后定容至1L。

取上述磷酸氢二钠溶液85ml和磷酸二氢钾溶液15ml混合均匀。

操作方法
1 取样：按《茶取样》的规定取样。

2 试样的制备：按《茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定GB/T
8303-2002》的规定，制备试样。

3 测定步骤：
(1)试液的制备：按《茶水浸出物测定GB/T 8312-2002》中的11.1的规定，制备试液。

(2)测定：准确吸取上述(1)试液1mL，注入25mL的容量瓶中，加水4mL和酒石酸亚铁溶液5mL，充分混合，再加pH7.5的缓冲液至刻度，用10mm比色杯，在波长540nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(A)。

4、结果计算：计算方法和公式
茶叶中茶多酚的含量，以干态质量百分率表示，按下式计算：
茶多酚(%)=【(A×1.957×2)/1000】×【L1/(L2×M0×m)】×100
式中：L1——试液的总量，mL；L2——测定时的用液量，mL；
M0——试样的质量，g；m——试样干物质含量百分率，%；
A——试样的吸光度；1.957——用10mm比色杯，当吸光度等于0.50时，每毫升茶汤中含茶多酚相当于1.957mg。

5、如果符合重复性的要求，则取两次测定的算术平均值作为结果。

重复性同一样品的两次测定值之差，每100g试样不得超过0.5g。

茶游离氨基酸总量的测定（GB/T 8314-2002）
本标准适用于茶叶中游离氨基酸总量的测定。

引用标准：GB/T 8302-2002 茶取样；GB/T 8312-2002 茶咖啡碱测定；
GB/T 8303-2002 茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定；
GB/T 8313-2002 茶茶多酚测定
定义：
游离氨基酸free amino acids：茶叶水浸出物中呈游离状态存在的具有a-氨基的有机酸。

原理：a-氨基酸在ph8.0条件下与茚三酮共热，形成紫色络合物，用分光光度法在特定波长下测定其含量。

仪器和用具：分析天平；分光光度仪。

试剂和溶液：所用试剂应为分析纯，纯度不低于99%，水为蒸馏水。

1、pH8.0磷酸盐缓冲液：
1/15mol/L磷酸氢二钠：称取23.9g十二水磷酸氢二钾钠，加水溶解后定容至1L。

1/15mol/L 磷酸二氢钾：称取经110度烘干2h的磷酸二氢钾9.08g，加水溶解后定容至1L。

取上述磷酸氢二钠溶液95ml和磷酸二氢钾溶液5ml混合均匀。

2、2%茚三酮溶液：
称取水合茚三酮2g，加50ml水和80mg二水合氯化亚锡搅拌均匀。

分次加少量水溶液，放在暗处，静置一昼夜，过滤后加水定容至100ml。

3、茶氨酸或谷氨酸标准液：
称取100mg茶氨酸或谷氨酸溶于100ml水中，作为标准吸取5ml母液，加水定容50ml作为工作液（1ml含茶氨酸或谷氨酸0.1mg）。

操作方法：
1、取样：GB/T 8302-2002
2、试样制备：GB/T 8303-2002
3、测定步骤：
3.1 试液的制备：GB/T 8312-2002中11.1的规定。

3.2 测定：
准确吸取试液（3.1）1ml，注入25ml的容量瓶中，加0.5ml pH8.0磷酸盐缓冲液和0.5ml 2%茚三酮溶液，在沸水中加热15min。

待冷却后加水定容至25ml。

放置10min后，用5mm比色杯在570nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度A。

3.3 氨基酸标准曲线的制作：
分别吸取0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml茶或谷氨酸工作液于一组25ml 容量瓶中，各加水4ml，pH8.0磷酸盐缓冲液0.5ml和2%茚三酮溶液0.5ml，在沸水中加热15min。

待冷却后加水定容至25ml。

放置10min后，用5mm 比色杯在570nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度A。

将测得的吸光度与对应的茶或谷基酸浓度绘制标准曲线。

4、结果计算：计算方法和公式
茶叶中游离氨基酸含量，以干态质量分数表示，按下式计算：
游离氨基酸总量(以茶氨酸或谷氨酸计%)=【(C/1000)×（L1/L2）】/【M0×m)】×100 式中：L1——试液总量，mL；L2——测定用试液量，mL；
M0——试样的质量，g；m——试样干物质含量百分率，%；
C——根据测定吸光度从标准曲线上查的的茶氨酸或谷氨酸的毫克数。

5、重复性：同一样品的两次测定值之差，每100g试样不得超过0.1g。

采用比色法测定茶叶中游离氨基酸总量，测定原理为：氨基酸与水合茚三酮共同加热被氧化分解产生CO 、氨和比氨基酸少一个碳原子的醛，此时茚三酮被还原。

在弱酸性溶液中，还原茚三酮与氨及另一分子茚三酮缩合成蓝紫色化合物茚二酮胺(DYDA)DYDA在570nm处有最大吸收。

采用茚三酮比色法测定茶叶中游离氨基酸总量，确定以茶氨酸为标准的最佳反应条件。

结果表明，反应pH为8．0，缓冲液和显色剂的用量为0．5mL，沸水浴加热15min，冷却10min后加水定容到25mL在最大吸收波长570nm处测定吸光度。

1试验方法
1.1 茶氨酸标准溶液的配制：准确称取100mg茶氨酸(纯度不低于99％)溶于100mL 水中，作为母液，准确吸取5mL母液，加水定容至50mL，作为工作液(1mL含茶氨酸0．1mg)；2％茚三酮溶液配制：称取水合茚三酮(纯度不低于99％)2g，加50mL 水和80mg氯化亚锡(SnC1· 2H O)搅拌均匀，放在暗处，静置一昼夜，过滤后加水定容至100mL。

1.2 样品处理：称取3g(精确到0．0001g)粉碎混合均匀过60目筛样品于500mL锥形瓶中，加450mL煮沸蒸馏水，沸水浴锅中浸提45min，减压过滤至500mL容量瓶中，残渣用热蒸馏水洗涤2～3次，冷却，定容。

1.3 显色条件的选择：配制不同浓度的茶氨酸标准溶液和不同pH的缓冲溶液。

反应体系：取一定体积的待测溶液+0.5 mLpH8．0的磷酸盐缓冲液+0.5 mL 2％茚三酮的溶液，水浴加热，冷却蒸馏水定容至25mL，在570nm处测定吸光度。

研究不同pH、显色剂用量、加热时间和冷却时间对吸光度的影响。

结论：PH8.0，显色剂的用量为0.5mL，：加热15min时有最大吸光值。

桑叶中微量元素的测定
1. 1 预处理
将桑叶洗净, 在干燥箱中于60℃干燥至恒重, 粉碎, 过60目筛。

1. 2 样品处理
精确称取桑叶2.0000g, 置于坩埚, 在电炉上低温炭化至无烟, 固体表面有一层白色状。

然后转入马弗炉中, 于500-550℃条件下灰化5h，取出冷却[1] 。

1. 3 样品的消化
样品用18mL 浓HNO3消化24h, 然后加入3m1H2O2于电炉上加热30min, 至HNO3分解完全, 转入微波消解罐中, 微波消解9min, 取出。

冷却后转移至50mL 容量瓶, 用二次水定容，摇匀，过滤[2] 。

1. 4 测定
将上述样品用原子吸收分光光度计分别测定K、Ca、Na、M g、Mn、Fe、Cu、Zn、Cr、Pb、Co、Ni 12 种微量元素的含量。

结果见表1。

表1 桑叶中必须微量元素的含量
元素K Ca Na Mg Fe Mn Zn Ni Cu Co Cr Pb ug/g 31582 10817 202.25 3035 339.25 50.53 49.625 4.44 12.3 0.585 0.12 - 桑叶中富含人体必须的微量元素, 种类较齐全, 其中K、Ca、Mg 含量丰富, 其他微量元素含量顺序为Fe> Na> Mn> Zn> Cu> Ni> Co。

有害元素Cr, Pb均低于国家限定标准。

桑叶中总黄酮含量的测定
2. 1 预处理
将桑叶洗净, 在干燥箱中于60℃干燥至恒重, 粉碎, 过60目筛。

2. 2 超声波提取
精确称取桑叶粉末2.0000g, 经正交实验确定最佳提取条件为：用60%的乙醇, 超声波提取40min, 料液比为1: 30, 提取温度为50℃[3]。

2. 3 标准曲线的制作[4]
精确称取芦丁标准品0.0053g, 用60%乙醇溶解,定容至50mL, 浓度为0.1075mg
/mL。

准确移取标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL 置于10m l容量瓶中, 分别加入5% NANO2溶液0.3mL 摇匀, 放置6min, 再加入10% Al( NO3)3溶液
0.3mL 摇匀, 放置6min, 加1mol/L NaOH 溶液4mL，用60%乙醇定容, 放置
15min。

在510nm 处测定吸光度, 以溶液浓度C为横坐标, 吸光度A为纵坐标, 得回归方程为: C=0.2028A+ 0.0025, R2 = 0.9828。

2. 4 样品的测定
准确移取样品5mL两份置10mL容量瓶中, 一份用60%乙醇定容, 一份按标
准溶液测定操作, 在510nm 处测定吸光度, 得A1、A2, 则样品吸光度为A = A2 - A1。

按标准曲线计算桑叶中的总黄酮含量。

根据正交实验结果, 用60%乙醇, 以料液比1: 30,温度50e , 用超声波提取
40m in。

测得桑叶中的黄酮类化合物的浸出率可达4. 13%。

茶叶总黄酮含量的测定方法
亚硝酸钠-硝酸铝法:精密称取105℃下干燥恒重的芦丁纯品0.1000 g，用50%的乙醇溶解，摇匀，定容至100 mL，再取10 mL此标准液于100 mL容量瓶中，稀释、定容为0.1 g/L的芦丁标准品溶液，作为贮备液备用。

分别吸取上述芦丁标准液0. 00，0. 25，0. 5，1. 0，2. 0，3. 0，4. 0，5. 0 mL于10 mL比色管中，用50%乙醇稀释至5.00 mL，分别加入5% ( g/L)NaNO2试液0.3 mL，摇匀，静置6 min。

再加5%( g/L)Al (NO3 ) 3试液0.3 mL，摇匀，静置6 min，再加4% NaOH 4 mL，并用50% 乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，静置12-15 min。

于504-510nm处测试，以吸光度值为纵坐标，以显色液中芦丁的质量(mg)为横坐标，用最小二乘法进行回归，线性方程: Y = 4. 071 ×10- 2 + 0. 1159X，相关系数r = 0. 9992。

样品处理:茶叶:碧螺春、铁观音建。

准确称取1. 0000 g干燥并研碎的茶叶于锥形瓶中，按1∶70的固液比，加入50% 乙醇溶液，80℃水浴提取5 h。

抽滤，茶汤转移到100 mL的容量瓶中，50% 乙醇溶液定容。

分别按上述标准曲线的实验步骤进行测定。

食品中粗纤维的测定方法GB 5009.10-85 Method for determination of crude fiber in foods 本标准适用于植物类食品中粗纤维含量的测定。

1原理：在硫酸作用下，样品中的糖、淀粉、果胶质和半纤维素经水解除去后，再用碱处
理，除去蛋白质及脂肪酸，遗留的残渣为粗纤维。

如其中含有不溶于酸碱的杂质，可灰化后除去。

2试剂
2.1 1.25％硫酸。

2.2 1.25％氢氧化钾溶液。

2.3 石棉：加5％氢氧化钠溶液浸泡石棉，在水浴上回流8h以上，再用热水充分洗涤。

然后用20％盐酸在沸水浴上回流8h以上,再用热水充分洗涤,干燥。

在600～700℃中灼烧后，加水使成混悬物，贮存于玻塞瓶中。

3操作方法
3.1称取20～30g捣碎的样品（或5.0g干样品），移入500mL锥形瓶中，加入200mL煮沸的1.25％硫酸，加热使微沸，保持体积恒定，维持30min，每隔5min摇动锥形瓶一次，以充分混合瓶内的物质。

3.2取下锥形瓶，立即用亚麻布过滤后，用沸水洗涤至洗液不呈酸性。

3.3再用200mL煮沸的1.25％氢氧化钾溶液，将亚麻布上的存留物洗入原锥形瓶内加热微沸30min后，取下锥形瓶，立即以亚麻布过滤，以沸水洗涤2～3次后，移入已干燥称量的G2垂融坩埚或同型号的垂融漏斗中，抽滤，用热水充分洗涤后，抽干。

再依次用乙醇和乙醚洗涤一次。

将坩埚和内容物在105℃烘箱中烘干后称量，重复操作,直至恒量。

如样品中含有较多的不溶性杂质，则可将样品移入石棉坩埚，烘干称量后，再移入550℃高温炉中灰化，使含碳的物质全部灰化，置于干燥器内，冷却至室温称量,所损失的量即为粗纤维量。

3.4计算
G
X = ── × 100
m
式中: X--样品中含粗纤维的含量，％；G--残余物的质量（或经高温炉损失的质量），g; m--样品的质量，g。

附加说明：本标准由全国卫生标准技术委员会食品卫生标准分委员会提出，由卫生部食品卫生监督检验所归口。

本标准由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。

桑叶各化学成分的提取
1 总生物碱的提取
取桑叶380 g, 以蒸馏水煮沸提取3 次( 李向荣等, 2003) , 合并提取液, 进行离子交换, 用0. 5 mol/ L氨水溶液洗脱( 在洗脱液pH> 9 时开始收集) , 洗脱液减压浓缩, 用正丁醇800 mL 萃取洗脱液, 萃取3次。

合并萃取液, 减压浓缩, 挥干溶剂。

得黑色粉末A 2. 30 g。

用重量法( 肖崇厚, 2006) 测其含量, 桑叶总生物碱平均含量为27. 1% 。

2 总多糖的提取
取桑叶50 g 用沸水1 000 mL 提取3 次, 经过D-101 大孔吸附树脂, 柱流液减压浓缩, 用95%的乙醇静置沉淀, 得粗总多糖( 欧阳臻等, 2003) 。

用Sevag 法脱蛋白: 将粗总多糖溶于100 mL 水中, 用活性炭脱色, 过滤, 收集滤液置于分液漏斗, 加入氯仿B 正丁醇( 4 B 1) 400 mL, 分离弃去有机层及交界处的凝胶变性物质。

重复直到水相部分与茚三酮反应为阴性。

将水相部分浓缩, 用95% 乙醇静置沉淀, 沉淀先乙醇后丙酮, 反复淋洗至淋洗液无色, 减压干燥( 60 e ) , 得精制桑叶总多糖B 1. 52 g ( 白色无定形粉末) 。

用硫酸一蒽酮比色法测定, 桑叶精制多糖B 的含量为61. 8%。

3 总黄酮苷的提取
取桑叶1. 5 kg, 沸水15 L 煮3 次, 每次1 h, 合并提取液过滤, 滤液用D-101 大孔吸附树脂吸附( 80mm @ 800 mm, 流速10 mL/ min) , 至树脂吸附饱和;先用蒸馏水洗涤至无色, 再用80%乙醇洗脱。

洗脱液减压浓缩, 干燥得桑叶粗黄酮( 唐孟成等, 1996) 。

粗黄酮用无水乙醇回流提取3 次, 第一次1 h, 第二、三次各0. 5 h, 合并提取液, 过滤, 滤液减压干燥得精制黄酮C 43 g 。

经HPLC 外标法定量, 计算标样中总黄酮含量为27. 3%。