蛋白质化学及相关实验

蛋白质化学及相关实验

一．氨基酸混合物的分析分离

（一）分配层析法的一般原理

1. 混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在移动相(可以是)和固定相

( )两相分配系数

2.逆流分溶原理：一定量的某一溶质在一定量的溶剂系统中分配时，转移次数越多，即分溶管数越多，

其分溶曲线越集中，即峰形越窄而高，这样有利于混合物中各物质的完全分离。

(二) 层析方法

1.纸层析

(1)支持物:纸,纸上的羟基具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常有机溶剂作为流动相

(2)原理：是根据溶质物质的极性进行分离的。

相对迁移率 R f = X/Y 图3－8

2. 柱层析

(1)填充物：亲水性的不溶物质，如纤维素、淀粉、硅胶等。

(2)洗脱剂：与水不互溶的溶剂，如苯酚、正丁醇等。

3.离子交换层析

(1)离子交换树脂基质：是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯(单体)-苯二乙烯(交联剂)进行

聚合和交联反应生成的具有网状结构的不溶性的高分子化合物。

树脂一般都制成：球形的颗粒。

带电基团：是通过化学反应引入基质。

有阳离子和阴离子两种交换树脂。

(2)氨基酸与树脂的亲和力：取决于它们之间的静电吸引和氨基酸侧链与树脂基质间的疏水相互作用。

4.吸附层析

(1)吸附剂：如氧化铝、硅胶、活性炭等

(2)各种成分的分离过程: 溶解、吸附、再溶解、再吸附

(六)薄层层析

(七)气液层析

流动相为气体(氢、氦、氮)，固定相为涂渍在固体颗粒表面的液体时称为气液层析或气液色谱，简称为气相色谱。

(八)高效(压)液相层析HPLC

固定相支持剂颗粒很细，因而表面积很大。溶剂系统采取高压。

一、肽（是氨基酸的线性聚合物）

肽：一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物。其中的氨基酸单位称氨基酸残基。肽键：氨基酸间脱水后形成的共价键称肽键（酰氨键）

寡肽：25（10个）个氨基酸残基以下。

多肽：多于25个（10个）氨基酸残基的肽链。

环状肽：

肽和肽键结构

1.肽键的结构特点（P164）：

肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。

组成肽键的原子处于同一平面。

肽键中的C-N键具有部分双键特性，不能自由旋转,呈现相对的刚性和平面化。

肽键的亚氨基没有明显的解离和质子化。

除脯氨酸外，多以反式结构存在。

2.肽平面、肽单位、二面角

肽平面：连接在肽键上的六个原子共处于一个平面上。

肽单位：肽链主链上的重复结构，Cα- CO – NH – Cα。

二面角：在多肽链里，Cα碳原子刚好位于互相连接的两个肽平面的交线上。Cα碳原子上的 Cα- C 和 Cα–N 可以绕轴旋转，角度为ψ和φ，这就是α-碳原子上的一对二面角。它决定了由α-碳原子连接的两个肽单位的相对位置。

(二) 肽的物理化学性质

肽的晶体是离子晶格，溶点高。

具有两性解离和等电点：肽的酸碱性质－－决定于末端α-氨基和α-羧基及R基。

pH > R基pKa →[HA] < [A-]

pH < R基pKa → [HA] > [A-]

多肽链中可解离功能团的pKa值（记）

例：Gly – Glu – Lys – Ala

具有旋光性。

茚三酮反应、α-氨基和α-羧基及R基的反应。

茚三酮反应不是肽的特有反应。

N端是脯氨酸或焦谷氨酸时无α-氨基试剂的反应

具有双缩脲反应：（参看实验讲义）

具紫外吸收：在280nm处有最大吸收峰，可进行肽类定量测定。

(三)天然存在的活性肽

具有特殊的生理功能，常称为活性肽。

含有非蛋白质氨基酸和肽键。

例1：α- 鹅膏蕈碱（环状八肽，剧毒毒素。能与真核生物的RNA聚合酶II牢固结合而抑制酶的活性）。谷胱甘肽：γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸

一、蛋白质的一级结构（共价结构、化学结构）

指多肽链中氨基酸的序列。包括二硫键的位置。

（一）蛋白质一级结构的测定

要求

样品必须是均一的。纯度在97%以上

知道蛋白质的相对分子质量

1.测定蛋白质分子中多肽链的数目

经测定末端基（C端或N端），看蛋白质的摩尔数与末端基的摩尔数的比例？

2.拆分蛋白质分子的多肽链和二硫键

借助非共价相互作用缔合的（亚基之间）

采用变性剂：8mol/L尿素；6mol/L盐酸胍；SDS处理。

通过共价二硫桥（S－S）交联的

采用氧化剂或还原剂：将二硫键断裂。

3.分析每一多肽链的氨基酸组成

待测样品经酸(6mol/L HCl)和碱(5mol/L NaOH)完全水解，用氨基酸分析仪进行测定（或层析法）。

表示方法：每摩尔蛋白质中含氨基酸残基的摩尔数。或100克蛋白质中含氨基酸的克数。

4.测定多肽链的氨基酸序列

多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化

原理：选用专一性强的、断裂点少的、反应产率高的蛋白水解酶或化学试剂进行有控制的裂解。后将所得

混合物进行分离纯化。

常用方法：酶解法化学法

酶解法（P174）

胰蛋白酶：水解Lys、Arg的羧基所形成的肽键。

糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：R1＝ Phe、Trp、Tyr

嗜热菌蛋白酶：

胃蛋白酶：

氨肽酶

羧肽酶：

化学法

溴化氰水解法(CNBr):切割Met的羧基所形成的肽键。

用羟胺断裂:它断裂－Asn-Gly-,但专一性不高。蛋白质中出现机率低，适于分子量大的蛋白质序列的测定。

5.确定肽段在多肽链中的次序

例：胰岛素B链的测序(180页)

所得资料： N－末端残基H C－末端残基S

第一套肽段OUS PS EOVE RLA HOWT

第二套肽段SEO WTOU VERL APS HO

借助重叠肽确定肽段次序：HOWTOUSEOVERLAPS

6.确定原多肽链中二硫键的位置

采用胃蛋白酶：专一性低，切点多。肽段比较小，分离、鉴定比较容易。作用pH在酸性范围（2）有利于

防止二硫键发生交换反应。

肽段混合物进行Brown及Hartly的对角线电泳：

例：有一个A肽：

1）酸水解得到：Ala、Arg、Ser、Glu、Phe、Met；

2）当A肽与FDNB试剂反应后得：DNP-Ala；

3）当A肽用CNBr降解时得到：游离的Ser和一种肽；

4）当A肽用胰蛋白酶降解时得到两种肽：

一种含Ala、Arg，另一种含其它氨基酸

5）当A肽用糜蛋白酶降解时得到两种肽：

一种含Met、Ser，另一种含其它氨基酸；

问A肽的氨基酸排列顺序如何？

答：Ala－Arg－Glu－phe－Met－Ser

第五节蛋白质的性质、分离和纯化

二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀

三、蛋白质的变性与复性

四、蛋白质相对分子质量的测定