番茄下胚轴转化获得转基因植株

图! "#$% !
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下胚轴转化再生 &’()*)+’, -.$./.-0+#)/
（箭头所示为再生芽） +,-.’./,0 .1 /23 4!" (3567(（ )88.923:5 ;2.9; 83;6;/:1/ ;2../; 96/2 :5<31/6/6.7; )* 选择性再生培养基上的下胚轴 （放大倍数， >* 下胚轴上的转化再生芽 #& ? ） @8:1;A.8(35 ;2../; .1 2,-.’./,0（(:B16A6’:/6.1，#& ? ） %* 转化再生植株 @8:1;B316’ -0:1/; 61 /23 A0:;C;
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下胚轴有一部分玻璃化， 有一部分则形成逐渐增大 （图 # $ %） ， 少数则不能生根。生根的再生苗长至 & 的白色疏松状愈伤， 二者都失去分化能力。 经过炼苗， 将培养基冲洗干净， 栽入装有 ’( 以上时， 由绿色愈伤分化形成的小芽在 !" 中培养 # 周， 灭菌土的塑料杯中， 待幼苗长到比较健壮后， 移栽至 其生长正常。 多数能正常生根， 有些根长得很长， 并长出许多须根 瓦钵或大田，
而后在 /#? 的次氯酸钠 （有效氯 -? ） 中消毒 .4 =&@， 灭菌蒸馏水冲洗 " 次， 接种于 . A / %,# 培养基 （. A / 含量 %, 盐类和维生素 B .4 C A D 蔗糖 B $ ( 4 C A D 琼 脂， 中。/4 E 黑暗中发芽， 984 ( 2） " F 后转入光照培 光 养室， 幼苗生长条件为 /4 E 、 .- G 光照 A 2 G 黑暗， 照强度 . 2## ’H。 悬浮 细 胞 培 养： 烟 草 悬 浮 细 胞 56. 在 >*%, 液体培养基 （ %, 盐 类 B .## =C A D 肌 醇 B # ( -4
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转化植株的 234 检测 以质粒 -+D%EF 作阳性对照， 未转化再生植株叶
第一， 下胚轴的再生比子叶要快， 转化后再生芽的出
［P］ 现一般比子叶要早一两周， 这与 I0:;/68: 等 的研究 结果一致。第二， 下胚轴在操作方面具有以下特点，
片 GH) 为阴性对照， 利用 HI@! 引物对对照和转化 植株 GH) 样品进行扩增， 大多数植株能够扩增出约 （图 E） 。阳性对照能够扩增出 JKL =- 的预期电泳带 预期带， 而阴性对照则不能扩增出带来。表明转基 因番茄基因组中已经含有外源基因片段。
每个幼苗取 ) @ - 段下胚轴。 E:H 反 应 缓 冲 液、 ’ ( 0 @ & ( ’ >! 的小段， & ( 0 !!M8 # $ ;":8) 、 ’ ( ) !!M8 # $ 将下胚 轴 外 植 体 接 种 在 看 护 培 养 基 上， 每 皿 约 ?’ 7CPET、 引物各 2’ 5"、 & ( ) Z PD[ 酶以及 ) ! 8 模 板。 个， 置于光照培养室进行 & 7 预培养。 E:H 程 序 为 R*6 - !45； R-6 *0 T， ?’6 & !45， =)6 & 农杆菌培养： 在含有 A!. 的 $B 平板 （&’ " # $ 胰 !45， -’ 次循环； =)6 延伸 &’ !45； *6 保存。扩增产 化蛋白胨 % 0 " # $ 酵母提取物 % &’ " # $ CD:8 % &0 " # $ 物用 ’ ( 2\ 琼脂糖凝胶电泳检测。 琼脂） 上挑取农杆菌单 菌 落， 接 种 于 &’ !8 含 有 0’ （0 " # $ 酵母提取物 % !" # $ A!. 的 AE; 液体培养基 ’ (0 " # $ 酪蛋白水介物 % 2 " # $ 甘露醇 % ) " # $ 硫酸 铵 % 0 " # $ CD:8） 中过夜培养至对数中期 （ F( , ! & ( 。 ’） !"$ 转化再生 将 - @ * 皿下胚轴外植体转移到 0’ !8 灭菌三角 瓶中， 经以 ;< ’ ( ) （ ;< 盐类和维生素 % )’ " # $ 葡萄 糖， 稀释至 F( , G ’ ( & @ ’ ( ) 的农杆菌液接种 ./0 ( 2） 感染 0 !45， 并轻轻摇动三角瓶。用吸管吸去农杆菌 液， 将外植体转移到灭菌滤纸上吸干残留的菌液， 回 接到看护培养基上进行 & @ ) 7 的共培养。共培养 后， 将外植体小心转入选择性再生培养基 ;H<& （ ;< 盐类和维生素 % -’ " # $ 蔗糖 % & ( ? !" # $ IJ % &’’ !" # $ 9! % 0’’ !" # $ :KL （ ( 头孢霉素，:KLMJDN4!K）% = ( 0 上， （ ;< 盐类 " # $ 琼脂， ./? ( ’） ) @ - 周后转入 ;H<) 和维生素 % -’ " # $ 蔗糖 % ’ ( ) !" # $ IJ % & ( ’ !" # $ OAA % &’’ !" # $ 9! % -’’ !" # $ :KL ( % = ( 0 " # $ 琼脂， 中培养， 选择培养过程中及时清除掉农杆菌 ./0 ( 2） 污染的材料。 !"% 再生芽生根及移栽 待再生芽长至 & >! 左右时， 将其切下， 放入选 （ ;< 盐类和维生素 % ’ ( & !" # $ 择性生根培养基 H< 中生根。) 周后 OAA % 0’ !" # $ 9! % -’’ !" # $ :KL ( ） 对生根良好、 长至 0 >! 左右的转化苗进行炼苗， 移 栽至瓦钵或大田中。 !"& 转化植株的 ’() 检测 万方数据 转化再生植株小量法提取 基本参照 PQL43D ,CA，
番茄下胚轴转化获得转基因植株 !
欧阳波 李汉霞 张俊红 叶志彪!!
（华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室， 华中农业大学园艺林学学院， 武汉 !"##$#） 摘要 通过根癌农杆菌介导转化番茄 （ !"#$%&’()#$* &(#+,&*-+. %&’’( ） 下胚轴， 将外
源双价基因导入番茄， 获得了一批卡那霉素抗性苗， 经 )*+ 检测证明外源基因已经 整合到番茄基因组中。研究表明番茄下胚轴是良好的遗传转化受体， 具有操作简便， 节省番茄材料和再生速度快的特点。烟草细胞看护培养能够提高外植体的转化效率 和减少农杆菌对外植体的污染。 关键词 番茄；下胚轴；转化再生 , -!. ( /#" ( 中图法分类号
充分研磨， 取 &-’’’ 3 # !45 离心 & !45， !M8 # $ 的 CDF/， 0! 8 上清液加入 *R0 ! 8 ’ ( & !M8 # $ 的 P34T + :8（ ./2 ( 中， 混匀， 取 )! ’） 8 作 E:H 模板。 由上海生工生 CEP"引物根据 E34!K3 程序设计， 物技术有限公司合成， 其序列为： UM3VD37： 0’ AWA:AAP:WW:PW:P:PWAP -’ BD>XVD37： 0’ P:APPP:WAA::::AWAWP: -’ 未转化再生植株的 以质 粒 ,CA 作 阳 性 对 照， ,CA 作阴性对照。 E:H 扩增体系为， )0 ! 8 中含 & Y
选择 &0 7 # \ &0 7D^ TK8K>J4M5 *(R &(*
选择 -’ 7 # \ -’ 7D^ TK8K>J4M5 =() &0 ( &
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抗 +, 再生植株的获得 番茄下胚轴外植体经过看护培养基预培养、 农
杆菌感染、 共培养后， 经过 &’ 7 的选择培养， 约 *’\ 的下胚轴可形成明显的绿色愈伤， 随后在一些愈伤 上逐渐形成芽点， 并分化出小芽 （图 ) + A， 。其余 B）
*
结果与分析
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不同外植体转化效率和再生速度的比较 番茄子叶在选择培养基上的绿色愈伤形成能力
和转化频率均比下胚轴要高 （表 &） 。在形成的绿色 愈伤中， 只有部分能分化出芽。而再生速度则表现 为下胚轴快 （表 )） 。
表!
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不同外植体的转化效率
&%"’ ()"’*+,)-"(.,’ %++./.%’/0 ,+ 1.++%)%’( %23$"’( 绿色愈伤比例 # \ W3KK5 >D88_T 3DJ4M ! "’ ( ’0 *= ( 0 ‘ ) ( * D -R ( - ‘ ) ( - a 转化频率 # \ P3D5TLM3!DJ4M5 3DJ4M ! "’ ( ’& )& ( 2 ‘ - ( * D =() ‘ &(- a
)*+" ! 图! 质粒 #$%&’( 的结构 ,-. /0123021. 45 #67/8*9 #$%&’(
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无菌苗和烟草悬浮细胞培养 无菌苗培养： 番茄种子用 $#? 酒精消毒 . =&@，
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材料与方法
材 料 番茄自交系： 中蔬 4 号， 实验室自备。 34" 、 烟草悬浮细胞： 实验室自备。 56.，
根 癌 农 杆 菌：超 毒 菌 株 783.#4，含 质 粒 质粒上构建有双价基因菜豆碱性几丁质酶 98:*";， 基因和烟草碱性 !< .， 质粒筛选 " < 葡聚糖酶基因， 标 记 为氨苄青霉素 （ 3=9） ， 转基因植株的筛选标记为
收稿日期： /### < #" < .4 武汉市科技攻关资助项目 （;;/##/#!4:） ! !!通讯作者 欧阳波， 男， 年生， 华中农业大学园艺林学学院博士生 ( 武汉 !"##$# 万方数据 .;$"
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［R］ ［&’］ 和 SD5" 等 的方法进行。取番茄幼嫩叶片一 !" # $ 盐酸硫胺素 % &’’ !" # $ 磷酸二氢钾 % ’ ( ) !" # 等 约 )’ !"， 置于 & ( 0 !8 离心管中， 加入 &’’ ! $ )， * + , % ’ ( & !" # $ 激动素 % -’ !" # $ 蔗糖， ./0 ( 0） 片， 8 ’( 0
外植体类型 ]N.8D5J J^.K 子叶 >MJ^8K7M5 下胚轴 /^.M>MJ^8
表*
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不同外植体再生速度
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4%5%’%)"(.’5 *3%%1 ,+ 1.++%)%’( %23$"’(
外植体类型 ]N.8D5J J^.K 下胚轴 /^.M>MJ^8 子叶 >MJ^8K7M5
通过子叶、 叶片、 下胚轴及胚根等诱导再生芽， 其优 势在于再生周期较短， 变异低。
［/ 0 -］ 番茄的植株再生和遗传转化报道较多 ， 其 ［$］ 再生能力一般为叶片 " 子叶 " 下胚轴 ， 而再生芽 ［2］ 的发生速度则是下胚轴 1 子叶 1 叶片 。番茄的再
生能力存在基因型的差异。为了提高番茄外植体的 利用率、 研究下胚轴与子叶转化再生后的转基因植 株变异及外源基因表达差异等方面， 我们通过下胚 轴再生的方法获得了转基因番茄植株， 将病程相关 蛋白基因 （菜豆几丁质酶基因和烟草葡聚糖酶基因） 导入番茄基因组。
其体积小， 每皿能容纳的外植体数量比子叶多 N 倍 以上。由于下胚轴粘附在滤纸上， 可以整张滤纸操 作， 在由共培养转入选择培养基时， 只需将滤纸倒扣 在选择培养基上小心压实， 下胚轴就能转移到选择 培养基上。 利用下胚轴转化再生的最大缺点在于农杆菌在 选择过程中比较难控制， 可能是下胚轴的再生能力 相对较弱， 同时维管束比较发达， 农杆菌能够侵入维 管束里面而难以接触到抗生素等方面所致。可以通 过降低农杆菌的侵染浓度 （ Q* G R L * N） 、 选择培养起
遗传转化成为农作物改良的有力工具， 它依赖 于作物组织培养和再生技术。组织培养和基因转移 技术的发展大大提高了一些植物的转化效率。植物 的再生方式主要包括体细胞胚再生和离体器官再生
［.］ 方式 。番茄转化过程中主要采用器官发生方式，
ห้องสมุดไป่ตู้
磷酸新霉素转移酶基因 （ 5)6 " ） ， 用卡那霉素 （ >=） 筛选 （如图 .） 。该质粒由作物遗传改良国家重点实 验室孟金陵教授提供。
中培养， 每周按 ) 1 *2 稀释继代， &2’ 3 # !45、 )0 6 暗培 养。 !"# 外植体准备和农杆菌培养 在分离外植体前 & 7 准备烟草看护培养基。将 生长 了 & 周 的 烟 草 悬 浮 细 胞 吸 取 & ( 0 !8， 转移到 （9:;< % = ( 0 " # $ 琼脂） 上， 覆盖一 9:;< 固体培养基 张直径 = >! 的灭菌滤纸， )06 过夜培养备用。 外植体准备： 取发芽后 ? 7 的幼苗， 在看护培养 基上用 刀 片 切 去 子 叶， 将靠近茎尖的下胚轴切成