免疫细胞的分离与功能测定

㈡血小板的去除 1 .PBMC经洗涤2～3次可去除大部分血小板 2 .胎牛血清(FCS)梯度离心 1ml PBMC悬液（1×107～2×107/ml）用 3ml FCS 800r/min 水平离心15min，18～20℃
㈢单核细胞的去除

1 .粘附去除法





原理 单核细胞可粘附在玻璃或塑料表面 ⑴PBMC用完全RPMI-1640调整浓度至 2×106/ml ⑵将50ml细胞悬液移入150cm2 培养瓶，37℃ 5﹪CO2 95﹪湿度培养1h ⑶收集非粘附细胞，再用预温至37℃的 RPMI-1640 ,轻轻荡洗培养瓶并收集荡洗液 ⑷1300r/min 离心10 min，18～20℃ ⑸弃上清，用5～10ml完全RPMI-1640悬浮 细胞计数，用台盼蓝染色检查细胞活性


3.免疫磁性微珠分离法 原理 羊抗鼠Ig + 磁性微珠→免疫磁性微珠 T细胞 + 抗某种亚群分化抗原的抗体 ↓ 加免疫磁性微珠 ↓ 在外加磁场作用下，该亚群T细胞连同免疫 磁性微珠一起沉降

㈠ T细胞的分离 1 .尼龙棉柱法 原理 B细胞易粘附于尼龙棉纤维，而T细胞 则否



尼龙棉（聚酰胺纤维）预处理 尼龙棉（聚酰胺纤维）50mg在0.2mol/L HCl浸泡过夜，用大量蒸溜水漂洗，晾干。 尼龙棉柱制备 塑料软管 长12～16cm 内经5～6mm 壁厚 0.2 mm高6cm的尼龙棉柱可有效地滤过 20×106～30×106个细胞.此法分离的T细胞 纯度可达90﹪以上


2. L-亮氨酸甲酯去除法 溶酶体酶→L-亮氨酸甲酯 →L-亮氨酸-L-亮氨酸甲酯 此法也可清楚NK细胞和细胞毒性T细胞 本法只适用于分离新鲜细胞


⑴用PBS调整细胞浓度至3×1065×106/ml， 用无血清RPMI-1640配制10mmol/L的L-亮 氨酸甲酯溶液（临用时配），两液按1︰1比 例混合，室温40min ⑵1300r/min 离心10 min，用HBSS或PBS洗 涤沉淀共3次 ⑶用完全RPMI-1640悬浮细胞，用无菌尼龙 网过滤，离心并计数，调整细胞至所需浓 度



㈡ T细胞亚群的分离 1. 间接免疫吸附分离法 原理 T细胞 + 抗某种T细胞分化抗原的抗体 ↓ 加入包被有羊抗鼠Ig的平皿



2 .抗体/补体介导的细胞毒作用分离法 原理 是一种负性分离法 T细胞 + 抗某种需去除T细胞分化抗原的抗 体+补体→该亚群T细胞裂解 如 T细胞 + 抗CD4抗体 + 补体→CD4+细 胞裂解 T细胞 + 抗CD8抗体 + 补体→CD8+细胞 裂解
免疫细胞的分离与功能测定
一 外周血单个核细胞的分离

原理: 密度梯度离心， 利用密度为1.077±0.001g/L 淋巴细胞分层 液（聚蔗糖-泛影葡胺）
2000 r/min 20min
血浆 淋巴细胞 分离液 粒细胞 红细胞
Ficoll分离液法




主要步骤 1 无菌采集静脉血，抗凝（每1ml全血加0.1ml 125～ 250U /ml 肝素溶液） 2 用等体积Hanks平衡盐溶液(HBSS)或pH7.2～7.4 PBS 稀释 3 按每10ml稀释血用3～5ml淋巴细胞分层液的比例 先将淋巴细胞分层液加入离心管中，再小心沿管壁 缓慢加入稀释血，注意切勿使血液混入分层液 4 2000r/min 水平离心30min， 5 吸取分层液与血浆交界部位的单个核细胞，用5倍 体积的HBSS或RPMI-1640洗涤2次依次以2000 r/min， 1500 r/min离心10min 6 用完全RPMI-1640定容，计数。一般每ml健康成 人血可分离出1×106～2×106单个核细胞 7 台盼蓝染色，检查细胞活性，活细胞应﹥95﹪。


2 .花环形成分离法 原理 T细胞表面有绵羊红细胞受体，可与 绵羊红细 胞结合形成花环. 绵羊红细胞用2-氨基乙基异硫脲溴化物 （AET）或神经氨酸酶（NM）可提高花环 形成的效果和稳定性

⑴1ml PBMC悬液(1×107/ml)、2ml NCS和 1ml 4﹪AET-SRBC悬液混匀，37℃水浴10 min ↓ 800r/min 4℃离心5 min，冰浴1h 或 800r/min 室温离心10 min，4℃2h ↓ 置淋巴细胞分层液（3～5ml分层液可分离 10mlPBMC/NCS/AET-SRBC混合液） ↓ 1300r/min 离心25 min，18～20℃ 或 2000r/min 离心35 min，4℃ 位于界面的是非花环形成细胞，沉淀的是花环形 成细胞



⑵1ml PBMC悬液(1×107/ml)、2ml NCS和 2ml 2﹪NM-SRBC悬液混匀，37℃水浴10 min 以下步骤同⑴ 经1次花环形成试验所得到的花环形成细胞 中，T细胞﹥95﹪，B细胞﹤1﹪，单核细胞 约为2﹪。经2次花环形成试验后，非花环 形成细胞中T细胞﹤2﹪ 用此法时，因SRBC与受体结合可激活某些 T细胞，导致功能增强

3. 羰基铁吞噬离心法




在抗凝血中加入一定量羰基铁粉，37℃搅 拌15 min，然后用淋巴细胞分层液离心分离 亦可先分离PBMC，再加羰基铁粉分离去除 单核细胞 粘附法去除单核细胞后，大约95﹪为淋巴 细胞，活性＞95﹪ L-亮氨酸甲酯法，99﹪为淋巴细胞，活性 ＞95﹪
三 外周血淋巴细胞选择性分离



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注意事项 1 严格无菌操作 2 操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀 3 淋巴细胞分层液应4℃避光保存，取出后 待温度升至室温使用 4 如须保存血浆作他用，则不能稀释血液 5 离心最适温度18～20℃ 6 分离组织中的单个核细胞也可采用上法
二 淋巴细胞的纯化


㈠红细胞的去除 1 低渗裂解法 1ml蒸溜水加入沉淀的PBMC中，轻摇（﹤1min） 立即加入1.8﹪NaCl, 洗涤 2 氯化铵处理法 沉淀的PBMC中加入1ml 0.83﹪氯化铵溶液，轻 摇2 min，洗涤