(5)第三章 代谢控制发酵思想

• 在多数情况下，抗类似物突变株的选育应 该与营养缺陷型的筛选相配合
《代谢控制发酵》
2、营养缺陷型回复突变株的应用
• 原理： 并非所有的代谢产 物都能找到结构类似物， 物都能找到结构类似物 ，• 或多重交叉难以增加抗 性标记， 性标记 ， 或反馈调节很 复杂时， 复杂时 ， 可用营养缺陷 型回复突变株的方法来 选育高产菌株 。 当一个菌株由于突变而 失去某一遗传性状后， 经过回复突变可以在回 复其原有的遗传性状。 但这个回复并非原有酶 的回复，往往只有催化 活性而无调节位点
核糖、乙酰辅酶A等，获得这些物质必须在遗传水平上打 破微生物自身的代谢调节机制. 5 微生物自身不能合成，自身也不需要的外源基因产
物。
《代谢控制发酵》
• 代谢控制发酵工程能否获得成功，目的产物产量 的高低，取决于微生物细胞自我调节控制是否能 够解除或解除的程度。
• 能否解除微生物的自我调节控制机制，而使代谢 产物大量积累的是代谢控制发酵育种的关键。
菌体及终端产物
初级代谢产物（如酶类）
基因改造
次级代谢产物（如抗生素）
大分子合成素材性产物
基因导入
外源基因产物
《代谢控制发酵》
1 2 3 4
微生物终端产物:乳酸、酒精、CO2、乙酸、丙 酮丁
醇、酵母等。 微生物生长自身必须的产物，如，糖化酶、蛋白酶、
果胶酶等。 微生物的次级代谢产物，如抗生素等 素材性中间代谢产物，如，氨基酸、核苷酸、有机酸、
需要添加缺失的该物质才能在基本培养基上生长
《代谢控制发酵》
营养缺陷型应用举例 （一）
• 5，-肌苷酸二钠（IMP) 5，-肌苷酸二钠又名肌 苷酸钠，简称5‘-IMP，为白 色结晶或结晶性粉末，含有 约7.5分子结晶水。无臭，有 特别强的鲜味。
肌苷发酵是通过代谢流的堵塞来消除终产物的反馈 调节，以达到中间产物的积累的。
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“五字方针”: 进、通、节、堵、出 五字方针”:
E
A
B
C
D
F
D
《代谢控制发酵》
第三章 微生物代谢控制发酵
第一节 代谢控制发酵的基本思路 一、切（阻）断代谢支路 二、解除反馈调节 三、增加前体物质的合成 四、特殊调节机制的利用
《代谢控制发酵》
相关的常用名词
• 营养(nurture)：生物体获得的或合成的营养素。 • 基本培养基（minimal medium）:
《代谢控制发酵》
谷氨酸发酵增加细胞透性的主要措施
• １生物素对细胞膜合成的影响 • ２青霉素对细胞壁合成的影响 • ３表面活性剂对细胞通透性的影响
《代谢控制发酵》
生物素的生理意义
• 乙酰辅酶A（CｏＡ）羧化酶的辅酶，参与 脂肪酸的生物合成，脂肪酸是形成细胞膜 磷脂的主要成分，从而间接地起到干扰细 胞膜磷脂合成的作用。
鸟嘌呤核苷酸GMP
营养缺陷型应用举例 （二）
• 必需氨基酸： 赖氨酸（Lys）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、 蛋氨酸（Met）、苏氨酸（Thr）、亮氨酸（Leu）、异 亮氨酸（Ile）、缬氨酸（Val）。
赖氨酸为碱性必需氨基酸。由于谷物食品中的赖氨酸含量甚 赖氨酸 低，且在加工过程中易被破坏而缺乏，故称为第一限制性氨 基酸。
AK 天冬氨酸激酶； 天冬氨酸激酶； PS 二氢吡啶二羧酸合成酶 HD 高丝氨酸合成酶； 高丝氨酸合成酶； HK 高丝氨酸激酶
高丝氨酸缺陷型菌株 缺失HD酶 缺失 酶
↓AK ↓ 天冬氨酰磷酸 ↓ 天冬氨酸半醛
限量添加高丝氨酸
PS↙ 二氨基庚二酸(DAP) 二氨基庚二酸(DAP) ↓
↘HD 高丝氨酸（ 高丝氨酸（Hom) ↙HK ↘
《代谢控制发酵》
影响细胞膜透性的其他措施
• １丧失脂肪酸合成油酸缺陷型
• ２丧失α －磷酸甘油脱氢酶的甘油缺陷型
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青霉素对细菌细胞壁合成的影响
• 青霉素属ß－内酰胺类抗生素，主要抑制粘 肽的合成，阻止粘肽链的交叉连接，使细菌 无法形成坚韧的细胞壁。
表面活性剂对细胞透性的影响
• 表面活性剂破坏细胞膜的脂质双分子层结构 ， 表面活性剂破坏细胞膜的脂质双分子层结构， 选择透性失控。 选择透性失控。
赖氨酸
Ala--
苏氨酸 亮氨酸
• 乳糖发酵短杆菌 • 赖氨酸
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葡萄糖 天冬氨酸
AK 天冬氨酸激酶； 天冬氨酸激酶； PS 二氢吡啶二羧酸合成酶 HD 高丝氨酸合成酶； 高丝氨酸合成酶； HK 高丝氨酸激酶
高丝氨酸缺陷型菌株 缺失HD酶 缺失 酶
↓AK ↓ 天冬氨酰磷酸 ↓ 天冬氨酸半醛
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• 抗结构类似物突变株，代谢失常，结构 类似物不能与关键酶或阻遏蛋白结合而 改变酶的活性。可以使合成途径不能受 到产物的反馈调节，因此，终产物可以 积累，该菌体处于非健康生长状态。
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抗类似物突变株应用举例 精氨酸 Arginine
在幼儿生长期，精氨酸是一种必需氨基酸 精氨酸的免疫调节功能，可防止胸腺的退化（尤其是受伤后 的退化），补充精氨酸能增加胸腺的重量，促进胸腺中淋巴 细胞的生长。 补充精氨酸还能减少患肿瘤动物的体积，降低肿瘤的转移率， 提高动物的活存时间与存活率。 在免疫系统中，除淋巴细胞外，吞噬细胞的活力也与精氨酸 有关。加入精氨酸后，可活化其酶系统，使之更能杀死肿瘤 细胞或细菌等靶细胞。
《代谢控制发酵》
增加透性的措施
• 1 生物素亚适量 • 2 添加青霉素 • 3 吐温80 • 改变细胞膜的透性，使优先合成的Glu 很快渗漏到细胞外，解除了反馈调节， 发酵得到Glu。
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三、增加前体物质的合成
葡萄糖 协同反馈抑制 丙酮酸
丙氨酸
天冬氨酸
天冬氨 酰半醛
二氢吡啶 二羧酸 反馈阻遏
《代谢控制发酵》
谷氨酸
谷氨酸棒杆菌
Coynebacterum glutamicum
N-乙酰谷氨酸
N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸 N-乙酰-谷氨酸γ-半醛
N-乙酰鸟氨酸 鸟氨酸 瓜氨酸 D-精氨酸抗性突变株 精氨琥珀酸 精氨酸氧污酸盐抗性 突变株 精氨酸
《代谢控制发酵》
• 在分支代谢途径中单使用抗类似物突变株 提高目标产物量的效果不明显。
野生型菌株（原养型）可以生长而该菌株的一切营 养缺陷型均不能生长的培养基。
• 完全培养基（Complete medium）:
所含有的营养成分足以供给原养型和营养缺陷型菌 株的生长的培养基。常用于菌种的选育和微生物遗传学 研究等。
《代谢控制发酵》
• 加富培养基，enriched medium: • 又称富集培养基。一般为在普通培养基中加入额 外的营养物质的培养基。加入的额外营养物质诸 如血、血清、动植物或微生物细胞的提取物等营 养丰富物质。常用于菌种筛选中，使所筛选的微 生物在其中生长比其它微生物迅速而淘汰掉其他 微生物。 • 结构类似物 • 与代谢途径中的代谢产物结构相类似，能与代谢 物一样与调节酶结合引起酶活性的变化，但不具 有代谢物生理功能的一类化合物。
《代谢控制发酵》
肌苷（IR） 次黄嘌呤核苷
• 肌苷酸发酵
腺嘌呤缺陷型（Ade-） 黄嘌呤缺陷型（Xan-） 鸟嘌呤缺陷型（Gua-）
5－磷酸核糖焦磷酸 PRPP
谷氨酰胺
PRPP转移酶 5－磷酸核糖胺
5’-IMP 肌苷酸
腺嘌呤核苷琥珀酸 SAMP
黄嘌呤核苷酸XMP
腺嘌呤核苷酸 AMP 枯草芽孢杆菌
《代谢控制发酵》
• 代谢互锁 Metabolic interlock
一种代谢产物的代谢调节，受来自另外一 种从生物合成途径来看似乎完全无关的终产物 的控制，这种现象叫代谢互锁
《代谢控制发酵》
一、切（阻）断支路代谢
措施： • 选育营养缺陷突变株
• 选育渗漏缺陷突变株
《代谢控制发酵》
1、营养缺陷菌株的应用
• ①合成途径中某一步骤发生缺陷，致使终产物不能积累 • ②实质上（遗传性的）解除了终产物的反馈抑制或反馈 阻遏 • ③中间产物或另一分支途径的末端产物得以积累 • ④对某一的产物的积累，起到节约碳源的作用
《代谢控制发酵》
营养缺陷突变株
(Auxotroph)
• 指原菌株由于发生基因突变，致使合成途 径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成 某些物质的能力，必须在培养基中补加该 营养物质才能生长的突变型菌株。
《代谢控制发酵》
• 渗漏型突变株
指遗传性障碍不完全的缺陷型。由于这种 突变是它的某一种酶的活性下降而不是完全丧 失，因此，渗漏缺陷型能够少量地合成某一代 谢最终产物，能在基本培养基上进行少量的生 长
《代谢控制发酵》
• 正常细胞
H
一个具有正常代谢的微生物，其代谢产物 的结构类似物不可逆的抑制了或阻遏了合成 该代谢产物的合成酶类（作用机理），使菌 体不能正长，直至死亡。
《代谢控制发酵》
菌体怎样成为抗类似物突变株？
•抗类似物突变株，又称代谢拮抗物抗性突变株 • （1）变构酶的结构基因发生突变，使变构 调节部位不再能与类似物结合，其活性中心 不变 • 该突变株的正常代谢物，由于与类似物结构 类似，所以也不能与变构酶的调节部位结合， 解除了反馈抑制，即使有大量终产物，仍能 继续合成。（抗反馈抑制突变型菌株）
赖氨酸(Lys) 苏氨酸(Thr) 蛋氨酸(Met) 赖氨酸(Lys) 苏氨酸(Thr) 蛋氨酸(Met) ↓ 异亮氨酸
谢控制发酵 谷氨酸棒杆菌Lys合成途径 谷氨酸棒杆菌 《 代合成途径 》
2、渗漏突变株的应用
• 特点： • • • 1 解除了反馈调节； 2 在基本培养基上生长； 3 积累其他分支途径的终产物。
《代谢控制发酵》
举例说明 二
• 另一条途径： Demain先将绿链 霉菌诱变成不产 金霉素的突变株， 然后再进行回复 突变，结果期金 霉素的产量提高 了6倍。
《代谢控制发酵》
3、增加细胞透性,去除细胞内的终产物
• 改变细胞膜渗透性,将属反馈控制因子的终 产物迅速、不断地排出细胞外,不使终产物 积累到引起反馈调节的浓度,就可以解除反 馈控制。
《代谢控制发酵》
• 赖氨酸生产菌株有：谷氨酸棒杆菌；北京棒杆 菌；黄色短杆菌等。 • 合成苏氨酸蛋氨酸的途径的关键酶天冬氨酸激 酶是单一酶，受苏氨酸（Thr）和赖氨酸（Lys） 协同反馈抑制。 • 苏氨酸和赖氨酸单独一种存在时不受抑制，仅 当两者共存并都过量时才起抑制作用。
《代谢控制发酵》
葡萄糖 天冬氨酸
• 优点： • 在发酵过程中不需要添加营养确实的 物质。
《代谢控制发酵》
二、解除菌体自身的反馈调节
措施： • 选育抗类似物突变株 • 选育营养缺陷型回复突变株 • 选育细胞膜通透性突变株
《代谢控制发酵》
1、选育抗类似物突变株
• 结构类似物 • 与代谢途径中的代谢产物结构相类似，能 与代谢物一样与调节酶结合引起酶活性的 变化，但不具有代谢物生理功能的一类化 合物。
α-氨基-β-羟戊酸 氨基ＡＨＶ突变株 抗 ＡＨＶ突变株
乙酸
黄色短杆菌
乙酰磷酸
乙醛酸
增强分支点的代谢流， 增强分支点的代谢流 ， 使分支点 处的代谢产物增多。 处的代谢产物增多。
谷氨酸
增强分解途径的代谢流， 增强分解途径的代谢流 ， 乙醛酸 循环加速，增加TCA通量控 制 发 酵 》 通量。 循环加速，增加 通量。 《代谢
《代谢控制发酵》
优
点ห้องสมุดไป่ตู้
• 反馈调节可以被遗传性地解除，在发酵时 可不易受培养基成分的影响，生产较稳定；
• 不易发生回复突变，在发酵生产上被广泛 采用。
《代谢控制发酵》
• （2）酶的调节基因发生突变，使阻遏蛋白 （阻遏物）不再能与类似物结合，其活性 不变 • 该突变株的正常代谢物，由于与类似物结 构类似，所以也不能与阻遏蛋白结合，解 除了反馈阻遏，即使有大量终产物，仍能 继续合成。（抗反馈阻遏突变型菌株）
限量添加高丝氨酸
PS↙ 二氨基庚二酸(DAP) 二氨基庚二酸(DAP) ↓
↘HD 高丝氨酸（ 高丝氨酸（Hom) ↙HK ↘
赖氨酸(Lys) 苏氨酸(Thr) 蛋氨酸(Met) 赖氨酸(Lys) 苏氨酸(Thr) 蛋氨酸(Met) ↓ 异亮氨酸
谢控制发酵 谷氨酸棒杆菌Lys合成途径 谷氨酸棒杆菌 《 代合成途径 》
《代谢控制发酵》
举例说明 一
• 绿 菌 （ Streptomyces viridifaciens）生产金霉素，在金霉素 的合成过程中，由蛋氨酸供应甲基，蛋 氨酸在细胞中的浓度高可以促进金霉素 的合成。 • 首先将绿链霉菌变成Met-，然后恢复Met ＋ ,这样就解除了蛋氨酸合成的反馈抑制， 提高了细胞中蛋氨酸的含量，进而5%的 回复突变株提高了金霉素1.2-3.2倍的产 量。 链 霉