植物基因工程在植物育种上的应用PPT课件

分离目的基因的方法
1、直接分离法一、限制性内切酶酶切分离法
二、酶促反转录法直接从特定 mRNA克隆基因
直接分离法获取基因
一、限制性内切酶酶切分离法
适于从病毒、质粒等简单基因组中分离目的基因。 优点是由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连 接。缺点是目的基因内部也可能有该内切酶的切点， 目的基因也被切成碎片。分为三种方法：
cDNA法的优点
①cDNA法能选择地克隆蛋白编码基因 ，而且由 mRNA反转录合成的cDNA对特定的基因而言只有 一种可能性，这样大大缩小了后续筛选样本的范围， 减轻了筛选工作量。
②cDNA法克隆的目的基因相当“纯净”，它既不 含有基因的5’端的调控区，同时又剔除了内含子 结构，有利于在原核细胞中的表达。
cDNA是与mRNA互补的DNA （Complementary DNA），它并非生物体内的 天然分子。将供体生物细胞的mRNA分离出来，利 用逆转录酶在体外合成cDNA，并将之克隆在受体 细胞内，通过筛选获得含有目的基因编码序列的重 组克隆；如果基因序列清楚，则直接用RT-PCR克 隆基因。这就是cDNA法克隆蛋白质编码基因的基 本原理。
③cDNA通常比其相应的基因组拷贝要小数倍甚至 数十倍，一般只有2-3Kb或更小，便于稳定地克隆 在一些表达型质粒上。因此，利用cDNA法将真核 生物蛋白编码基因克隆在原核生物中进行高效表达， 是基因工程常用的战略思想。
cDNA法的基本程序
mRNA的分离纯化 双链cDNA的体外合成
双链cDNA的克隆
1、对已定序的DNA分子，用已知的限制酶消化。
2、对已定位的基因，据基因两侧的序列选择内切 酶进行酶切。
3、鸟枪法
鸟枪法
对未定序和无定位的基因，先通过酶切 分析，再通过将某种生物体的全基因组或单 一染色体通过机械切割如超声波处理、部分 酶切和特定限制性内切酶全酶解（如果染色 体DNA上目的基因的两侧含有已知的限制 性内切酶识别位点，而且两者之间距离不超 过组克隆，从中钓出目的基因。
2、由序列部分互补或全互补的一套寡聚核苷酸单 链样本，通过彼此退火，可直接装配成双链DNA片 段或基因。
3、根据受体细胞蛋白质生物合成系统对密码子使 用的偏爱性，在忠实于目的基因编码产物序列的前 提下，更换密码子的碱基组成，从而大幅度提高目 的基因尤其是真核生物基因在原核受体中的表达效 率。
目前常用的方法
原理与磷酸二酯法一样。 只是参加反应的单核苷 酸都是在3’端磷酸和 5’-OH上都先连接了 一个保护基团。因此合 成的二核苷酸连接处有 三个酯键。
固相磷酸三酯合成法
固相磷酸三酯合成法是目前通用的合成方法。它是将第一个核 苷酸的3’-OH端固定在固相简称PCR，是体外酶促 合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、 低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组 成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速 扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、 省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆 和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病 的诊断或任何有DNA,RNA的地方。
1、磷酸二酯法 2、磷酸三酯法 3、亚磷酸三酯法 4、固相合成法 5、自动化合成法
磷酸二酯法的合成原理
① 保护dNTP的5’端P 或3’端-OH，以 保证合成反应的定向进行。
② 带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另 一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。
③ 用酸或碱的脱保护
磷酸二酯法合成过程
磷酸三酯法的合成
cDNA重组克隆的筛选
化学合成法
1976年H.G. Khorana提出了如果 目的基因的全序列是已知的，则可以 利用化学合成法直接合成基因的设想。 随着核酸有机化学的发展，目前已能 利用DNA合成仪自动合成不超过50个 碱基任何特定序列的寡聚核苷酸单链。
化学合成法的优点
1、化学合成的DNA单链小片段可以直接作为核酸 杂交的探针、分子克隆中的人工接头以及PCR扩增 中的引物 。
又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列 体外引物定向酶促扩增技术。
PCR技术的五要素和步骤
参加PCR反应的物质 主要有五种
引物 酶 dNTPary或Gene bank）是指NA片段，分 别与载体DNA在体外拼接成重组分子，然后导入受 体细胞中，形成一整套含有该生物体全基因组DNA 片段的克隆，并将各克隆中的DNA片段按照其在细 胞内染色体上的天然序部分片段，同时又能够在必需时从 基因中调出其中的任何DNA片段或目的基因。
③90%以上的真核生物结构基因都具有内含子结构，这种真 核基因不能在原核细菌受体细胞中表达，因此如果从真核生 物中克隆目的基因并在原核细菌中高效表达，使用鸟枪法显 然是不合适的。
直接分离法获取基因
二、酶促反转录法直接从特定mRNA克隆基因 用于合成分子质量较大、转录产物mRNA易分
离的目的基因。又称cDNA法。
植物基因工程在育种上的应用
目录
一、目的基因的分离和克隆 二、植物基因工程载体 三、外源基因导入植物受体的方法 和转基因植物的检测
目的基因的分离和克隆
目的基因的概念 分离目的基因的方法
目的基因的扩增
目的基因的概念
基因：DNA分子上含特定遗传信息的可算 序列总称，是遗传物质最小的功能单位。
目的基因：对基因组中某个基因通过克隆扩 增，获得该基因并进行研究和应用。简单说， 就是在基因工程中，被分离、操作和表达的 一种基因 。
鸟枪法的缺点
鸟枪法克隆目的基因有很大的局限性。
①在一般情况下，利用探针原位杂交法筛选和检测重组质粒， 可以较为简便地获得目的基因DNA片段，但若没有合适的探 针可用，鸟枪法克隆目的基因的工作量很大，如同盲人打鸟。
②鸟枪法实质上是克隆含有目的基因的DNA片段，如果目的 基因是用于构建高效表达系统，则需要的是其编码序列而不 是整个DNA片段，只有在其编码序列的上下游合适位点含有 特征的限制性内切酶识别位点，后续操作才能顺序进行，遗 憾的是这种情况并不多见。